一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法技术

本发明专利技术公开一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)采用无血清培养MSC细胞的方法，获得间充质干细胞(MSCs)来源的sEVs；(2)对步骤1中的sEVs进行切向流超滤、尺寸排阻色谱处理，制备得到临床级的sEVs。具有可操作性高、可实现规模化扩展、操作时长短、不依赖专有设备、蛋白性杂质去除率高等特点，可获得高纯度的临床级sEVs。可应用于烧伤烫伤，难愈合性溃疡及术后创伤修复领域、外泌体载药或者外泌体药物开发领域的临床应用研究。药物开发领域的临床应用研究。药物开发领域的临床应用研究。

【技术实现步骤摘要】
一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体的，涉及一种人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的纯化技术及在制药或医疗整形美容领域的应用。

技术介绍

[0002]人间充质干细胞(human mesenchymal stem cell)是一类贴壁培养后呈成纤维细胞样形态(纺锤形和梭形)、可在体外自我更新并具有成骨、成脂、成软骨等分化能力的干细胞。人间充质干细胞可由多种人体组织(如骨髓、脐带、胎盘、脂肪、脐带血等)分离得到，也可以通过分化或转分化等方式获得。小细胞外囊泡(small extracellular vesicles，sEVs)是由细胞经过“内吞
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融合
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外排”等一系列调控过程，主动分泌的具有双层膜结构的直径小于200nm的微小囊泡。其内含有功能性蛋白质、mRNA及microRNA等物质，在细胞间的信息传递过程中发挥重要作用，广泛参与机体损伤组织修复、基因交换、抗原呈递免疫反应、肿瘤转移等生理病理过程。
[0003]小细胞外囊泡(sEVs)尤其是间充质干细胞(MSCs)来源的sEVs越来越被认为是治疗各种不同疾病的生物治疗剂。为了将它们有效地转化为临床应用，需要满足药品生产质量管理规范(GMP)的可扩展生产流程。与其他生物治疗药物一样，sEVs产品的制造可以细分为上下游过程和后续质量控制，每个环节都包含多个单元操作。在上游处理(USP)期间，细胞被分离、储存(细胞库)和扩增；此外，还生产含有sEVs的条件培养基。在下游处理(DSP)期间，处理条件培养基(CM)以获得浓缩和纯化的sEVs产品。CM要么存储到DSP，要么直接处理。作为DSP中的第一个单元操作，澄清去除剩余的细胞、碎片和其他较大的杂质。每个批次小细胞外囊泡的DSP的关键操作是减少体积与纯化浓缩的EV相结合。
[0004]差速离心法是目前最常用的sEVs分离方法，其次还有密度梯度离心法、沉淀法、过滤法、尺寸排阻色谱法以及免疫亲和法等。然而，虽然sEVs的分离技术已经有了很大改进，但是实现sEVs的高纯度、高效率和无损伤的分离仍然是目前sEVs分离领域的主要挑战。比如差速离心法虽然是一种成熟的sEVs分离方法，但是该方法需要昂贵的设备，并且离心力会破坏sEVs的结构和功能，蛋白质的污染也会对sEVs的纯化产生一定的干扰；密度梯度离心法分离sEVs虽然较差速离心法分离纯度更高，但是分离介质的引入会导致sEVs的污染；沉淀法虽然能够高效地进行sEVs的分离，但沉淀介质会对sEVs的纯化产生一定的干扰；超滤法虽然操作简单，但是过滤膜的堵塞会导致sEVs回收率低，而且还会破坏sEVs的结构和功能；SEC虽然是一种分离纯度高、破坏性小的sEVs分离方法，但是由于对上样体积的严格要求，导致该方法只适用于小体积样本的提取；免疫亲和法虽然是目前特异性最好的sEVs分离方法，但是昂贵的试剂和严格的反应条件限制了该方法在大体积样本中的应用；微流控技术虽然是一种新兴的sEVs分离方法，但是受到抗体、滤膜、声波以及电场强度等影响较大，导致该方法的稳定性和重复性较差；基于适配体的磁分离法虽然较基于抗体的磁分离法更加稳定，但是有限的适配体限制了该方法的使用，因此，研发出高效特异性的sEVs分离和纯化方法仍然是sEVs研究和应用的核心环节。同时，确定合适的EV浓缩和纯化方法以扩
大规模是治疗性EV领域的主要挑战。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于使用一种无血清培养MSC细胞的方法，获得间充质干细胞(MSCs)来源的sEVs，在结合切向流超滤、尺寸排阻色谱的方法，可规模化从上清液中制备临床级的sEVs。具有可操作性高、可实现规模化扩展、操作时长短、不依赖专有设备、蛋白性杂质去除率高等特点，可获得高纯度的临床级sEVs。可应用于烧伤烫伤，难愈合性溃疡及术后创伤修复领域、外泌体载药或者外泌体药物开发领域的临床应用研究。
[0006]本专利技术技术方案：一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法，包含以下步骤：(1)采用无血清培养MSC细胞的方法，获得间充质干细胞(MSCs)来源的sEVs；(2)对步骤1中的sEVs进行切向流超滤、尺寸排阻色谱处理，制备得到临床级的sEVs。
[0007]所述的步骤(1)具体操作：(a)华通氏胶分离：将脐带组织按照规程的要求，分离出华通氏胶，用无菌组织剪将华通氏胶体剪切成1～4mm3的组织块；(b)接种：按照0.5～0.6g华通氏胶/T75瓶接种组织块，加入专用无血清培养基进行培养，期间根据培养情况进行换液，观察到细胞汇合度达到70％～80％时，进行细胞收获；(c)传代：根据收获原代细胞(P0)的数量和活力，将细胞悬液接种到T
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175培养瓶中，经标准条件培养并连续传代至P2，收获并冻存P2代细胞，作为种子细胞库；(d)MSC体外扩增及条件培养基(CM)获得：复苏P2代种子库细胞，进行扩增培养；观察到细胞汇合度达到70％～80％时，进行细胞收获，传代，收获MSC细胞及条件培养基，条件培养基离心，上清液再用滤膜过滤，
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80℃保存备用，作为小细胞外囊泡纯化起始原材料。
[0008]所述的切向流超滤具体操作：P2～P8代条件培养上清液，进行超滤浓缩，控制超滤系统的进口压力为30psi，出口压力为10psi，TMP为20psi，在此条件下浓缩20倍，截留液用无菌、无热源的PBS缓冲液开始连续洗滤，调整PBS缓冲液流入浓缩端的速度与透过端的一致，连续洗滤6DV,最后收集浓缩液。
[0009]所述的尺寸排阻色谱处理：填料颗粒直径为40～165μm，球形蛋白质分离范围为10～20000kD。
[0010]所述的步骤(b)的培养是将T75培养瓶放置于CO2培养箱中培养，37.0
±
0.5℃，CO2浓度为5％。
[0011]所述的尺寸排阻色谱处理：(1)SEC柱装填，要求柱高为15cm
×
20cm(D
×
H)，理论塔板数≥3000，不对称因子(As)为0.8～1.2；(2)柱平衡，先用无热源注射用水冲洗至少3CV柱体积(CV)，然后用0.5M氢氧化钠溶液清洗3CV，保持NaOH溶液接触填料及层析系统60min以上，无热源注射用水冲洗至流出端pH为中性；最后用pH7.2 PBS平衡至相应的pH与电导值；(3)sEVs纯化：用蠕动泵将经超滤初步浓缩及纯化含sEVs的浓缩液，加载到平衡好的SEC柱中，上样完毕后，切换pH7.2 PBS缓冲液，保持恒定的流速洗脱，根据洗脱体积及OD280变化，收集sEVs组分，
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80℃保存或根据制剂浓度需要进一步超滤浓缩。
[0012]本专利技术的有益效果：本申请使用一种无血清培养MSC细胞的方法，获得间充质干细胞(MSCs)来源的sEVs，在结合切向流超滤、尺寸排阻色谱的方法，超滤法的优势在于可容易实现大体体积样本的处理，同时可以去除条件培养基中90％左右的杂蛋白及小分子物质，在实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)采用无血清培养MSC细胞的方法，获得间充质干细胞(MSCs)来源的sEVs；(2)对步骤1中的sEVs进行切向流超滤、尺寸排阻色谱处理，制备得到临床级的sEVs。2.根据权利要求1所述的一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法，其特征在于：所述的步骤(1)具体操作：(a)华通氏胶分离：将脐带组织按照规程的要求，分离出华通氏胶，用无菌组织剪将华通氏胶体剪切成1～4mm3的组织块；(b)接种：按照0.5～0.6g华通氏胶/T75瓶接种组织块，加入专用无血清培养基进行培养，期间根据培养情况进行换液，观察到细胞汇合度达到70％～80％时，进行细胞收获；(c)传代：根据收获原代细胞(P0)的数量和活力，将细胞悬液接种到T
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175培养瓶中，经标准条件培养并连续传代至P2，收获并冻存P2代细胞，作为种子细胞库；(d)MSC体外扩增及条件培养基(CM)获得：复苏P2代种子库细胞，进行扩增培养；观察到细胞汇合度达到70％～80％时，进行细胞收获，传代，收获MSC细胞及条件培养基，条件培养基离心，上清液再用滤膜过滤，
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80℃保存备用，作为小细胞外囊泡纯化起始原材料。3.根据权利要求1所述的一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法，其特征在于：所述的切向流超滤具体操作：P2～P8代条件培养上清液，进行超滤浓缩，控制超滤系统的进口压力为30psi，出口压力为10psi，TMP为20psi，在此条件下浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦义，廖红军，杨恒，
申请(专利权)人：铜仁市泛特尔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：