一种识别酶的氨基酸候选突变位点的计算方法技术

本发明专利技术公开了一种识别酶的氨基酸候选突变位点的计算方法，所述计算方法包括酶蛋白铰链定位、残基进化保守性分析和能量计算。本发明专利技术首次采用整合酶蛋白铰链定位、残基进化保守性分析和能量计算三者一体化的方法筛选酶候选突变位点，实现了糖基转移酶突变位点的高精度快速筛选，显著提高了糖基转移酶对莱鲍迪苷D(RebD)生产莱鲍迪苷M(RebM)的酶活力，有效解决了该酶底物专一性差、催化活性不高等问题，降低生产成本，同时提高糖基转移酶的可溶性表达能力，有利于通过微生物发酵进行规模化生产，更适于商业和工业应用。更适于商业和工业应用。更适于商业和工业应用。

【技术实现步骤摘要】
一种识别酶的氨基酸候选突变位点的计算方法


[0001]本专利技术属于酶工程领域，涉及一种识别酶的氨基酸候选突变位点的计算方法。

技术介绍

[0002]糖的过量摄入会造成胰岛素抵抗，并导致代谢综合征，进而增加人体罹患高血压、糖尿病、心脑血管疾病等各种疾病的风险，是威胁人类健康的“主犯”之一。随着人们对健康饮食的关注，世界各国纷纷开展“减糖行动”，以甜菊糖苷为代表的一类绿色、健康的天然甜味剂受到了人们的青睐。甜菊糖苷是一种从菊科草本植物甜叶菊中精提的新型天然甜味剂，由一个共同的二萜甜菊糖骨架(配基)和一个主要由葡萄糖分子组成的可变乙二醇(甜菊糖苷)组成。甜菊糖苷的甜度是蔗糖的150
‑
300倍，而其热量仅为蔗糖的1/250，是继蔗糖和甜菜糖之后的第3种天然糖源，被誉为最有发展前途的新糖源，已经应用于烘焙、乳制品和饮料等食品的生产中。
[0003]根据糖基的种类、添加的位置C13和C19以及糖基数目的不同，可将甜菊糖苷类化合物分为甜菊醇、甜菊苷、莱鲍迪苷A、B、C、D、E和M等。莱鲍迪苷A(RebA)是目前甜菊糖的主要商业化产品，含量约占叶片干重的2
‑
4％，甜度为蔗糖的350
‑
450倍，但却具有一定的后苦味。相比之下，莱鲍迪苷M(RebM)具有甜度高、甜味感知迅速和口味纯净等优点，与其他已知甜菊糖苷相比极大地降低了甘草味、酸味、涩味和苦味等不良余味，使其成为高效天然甜味剂开发的首选目标。然而，RebM在甜叶菊叶片中的含量极低(约占0.4
‑
0.5％叶片干重)，采用传统的提取分离技术从叶片中制备RebM生产量少，且工艺繁琐，成本较高远远不能满足需求，是制约其工业应用的重要因素，所以利用生物催化法获得充足的莱鲍迪苷M引起了广泛的关注。
[0004]CN113462670A公开了一种糖基转移酶突变体及其催化合成莱鲍迪苷M的方法，所述方法通过定向进化对糖基转移酶UGT76G1进行分子改造，提高了其酶活以及催化效率，利用突变体实现了高效催化合成莱鲍迪苷M，但此方法未能实现UGT76G1突变位点的高精度快速筛选。
[0005]CN114574460A公开了一种利用糖基转移酶UGT76G1突变体高效生物合成莱鲍迪苷M的方法，所述方法通过对糖基转移酶UGT76G1进行基于蛋白质晶体结构的定向进化，成功获得高效突变体，并通过构建尿苷二磷酸葡萄糖UDPG循环体系，利用体外纯酶反应体系实现高效生物合成Reb M，但此方法未能实现UGT76G1突变位点的高精度快速筛选。
[0006]综上所述，目前现有的糖基转移酶突变体未能实现突变位点的高精度快速筛选，难以实现工业规模化生产。如何提供一种酶候选突变位点快速筛选方法，有效筛选突变位点，获得可溶性表达、催化活性高的糖基转移酶突变体，已成为目前酶工程领域亟待解决的问题之一。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种识别酶的氨基酸候选突变位点
的计算方法，解决了目前现有的糖基转移酶突变体未能实现突变位点的高精度快速筛选，难以实现工业规模化生产等问题，能够获得可溶性表达且催化活性高的糖基转移酶突变体。
[0008]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种识别酶的氨基酸候选突变位点的计算方法，所述计算方法包括酶蛋白铰链定位、残基进化保守性分析和能量计算；
[0010]所述酶蛋白铰链定位利用DFI函数进行计算，所述DFI函数通过计算长时间分子动力学模拟下的残基相关性矩阵获取每个残基的动态弹性指数，所述残基相关性矩阵通过计算分子动力学模拟下的蛋白质Cα的运动轨迹并以协方差矩阵的形式提供蛋白质中Cα原子波动的成对相关性，所述协方差矩阵用于计算扰动力引起的残基响应向量的公式如式(1)所示；
[0011]ΔR
3N
×1＝G
3N
×
3N
F
3N
×
1 式(1)；
[0012]其中，ΔR
3N
×1为扰动力引起的残基响应向量，G
3N
×
3N
为分子动力学(MD)模拟得到的协方差矩阵，F
3N
×1为扰动力向量；
[0013]按式(2)计算扰动响应矩阵；
[0014][0015]其中，A
N
×
N
为扰动力依次作用于蛋白质中的Cα原子，所获得的扰动响应矩阵，|ΔR1|1为位于位点1的扰动在位点1产生的波动响应幅度，|ΔR
N
|1为位于位点N的扰动在位点1产生的波动响应幅度，|ΔR1|
N
为位于位点1的扰动在位点N产生的波动响应幅度，|ΔR
N
|
N
为位于位点N的扰动在位点N产生的波动响应幅度，N为大于等于1的自然数；
[0016]按式(3计算)位点i残基的DFI得分DFI
i
；
[0017][0018]其中，DFI
i
为当酶蛋白链中的所有残基按顺序逐一被扰动时其净响应与所有残基被扰动时的净位移的比值，|ΔR
j
|
i
为位于位点j的扰动在位点i产生的波动响应幅度，i和j为大于等于1小于等于N的自然数；
[0019]所述残基进化保守性分析通过对目标酶家族(序列数>500)的多序列比较(MSA)计算的每个氨基酸在自然进化中的突变频率；
[0020]所述能量计算利用MMPBSA自由能分解工具和酶与目标底物或产物复合物的长时间分子动力学下的运动轨迹进行计算。
[0021]本专利技术中，所述长时间为时间>μs，DFI％小于0.2的区域被认为是与活性密切相关的铰链。
[0022]本专利技术首次采用整合酶蛋白铰链定位、残基进化保守性分析和能量计算三者一体化的方法筛选酶候选突变位点，可广泛应用于酶的遗传改造，例如对糖基转移酶突变位点的高精度快速筛选，显著提高了糖基转移酶对莱鲍迪苷D(RebD)生产莱鲍迪苷M(RebM)的酶活力，有效解决了该酶底物专一性差、催化活性不高等问题，降低生产成本，同时提高糖基转移酶的可溶性表达能力，有利于通过微生物发酵进行规模化生产，更适于商业和工业应
用。
[0023]第二方面，本专利技术提供了一种糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变体的突变位点由第一方面所述的识别酶的氨基酸候选突变位点的计算方法获得。
[0024]优选地，所述糖基转移酶突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生如下突变中的任意一种或至少两种的组合：P84V、L85V、M88V、S195V或L379V。
[0025]本专利技术中，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：
[0026]MGALTGTTVAAAAAIILPPVPPGGHIAPILGLAAVLTSLGPSITIPHTALPLTSA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种识别酶的氨基酸候选突变位点的计算方法，其特征在于，所述计算方法包括酶蛋白质铰链定位、残基进化保守性分析和能量计算；所述酶蛋白铰链定位利用DFI函数进行计算，所述DFI函数通过计算长时间分子动力学模拟下的残基相关性矩阵获取每个残基的动态弹性指数，所述残基相关性矩阵通过计算分子动力学模拟下的蛋白质Cα的运动轨迹并以协方差矩阵的形式提供蛋白质中Cα原子波动的成对相关性，所述协方差矩阵用于计算扰动力引起的残基响应向量的公式如式(1)所示；ΔR
3N
×1＝G
3N
×
3N
F
3N
×
1 式(1)；其中，ΔR
3N
×1为扰动力引起的残基响应向量，G
3N
×
3N
为分子动力学模拟得到的协方差矩阵，F
3N
×1为扰动力向量；按式(2)计算扰动响应矩阵；其中，A
N
×
N
为扰动力依次作用于蛋白质中的Cα原子，所获得的扰动响应矩阵，|ΔR1|1为位于位点1的扰动在位点1产生的波动响应幅度，|ΔR
N
|1为位于位点N的扰动在位点1产生的波动响应幅度，|ΔR1|
N
为位于位点1的扰动在位点N产生的波动响应幅度，|ΔR
N
|
N
为位于位点N的扰动在位点N产生的波动响应幅度，N为大于等于1的自然数；按式(3)计算位点i残基的DFI得分DFI
i
；其中，DFI
i
为当酶蛋白链中的所有残基按顺序逐一被扰动时其净响应与所有残基被扰动时的净位移的比值，|ΔR
j
|
i
为位于位点j的扰动在位点i产生的波动响应幅度，i和j为大于等于1小于等于N的自然数；所述残基进化保守性分析通过对目标酶家族的多序列比较计算每个氨基酸在自然进化中的突变频率；所述能量计算利用MMPBSA自由能分解工具和酶与目标底物或产物复合物的长时间分子动力学下的运动轨迹进行计算。2.一种糖基转移酶突变体，其特征在于，所述糖基转移酶突变体的突变位点由权利要求1所述的识别酶的氨基酸候选突...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵磊，王成涛，潘飞，赵亮，杨婷，刘雅琪，杨子辰，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：