一种罗伊氏黏液乳杆菌LR21及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种罗伊氏黏液乳杆菌，所述罗伊氏黏液乳杆菌为罗伊氏黏液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri 21（LR 21）；该菌株于2022年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022464，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。本发明专利技术的罗伊氏黏液乳杆菌对高温、人工胃液和肠液等均具有较高的耐受性且菌株肠上皮细胞粘附性良好，并且还具有突出的罗伊氏菌素合成能力，还对产气荚膜梭菌具有拮抗作用，具有开发成为新型预防产气荚膜梭菌感染的微生物添加剂的潜力。剂的潜力。剂的潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种罗伊氏黏液乳杆菌LR21及其应用


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一种罗伊氏黏液乳杆菌及其应用。

技术介绍

[0002]产气荚膜梭菌是一种厌氧性革兰氏阳性芽孢杆菌，根据其分泌的外毒素不同，分为A
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G共7种血清型，家禽主要感染A型和C型产气荚膜梭菌。产气荚膜梭菌感染家禽后，在各种环境诱因促使下在肠道内大量增殖并分泌毒素，最终引起鸡坏死性肠炎，该病主要症状表现为鸡精神萎靡、羽毛松乱、排焦煤油状或血便，食欲降低、生产性能严重下降，剖检后可见小肠肠壁变薄且充满气体，肠黏膜出现弥散性或大面积出血坏死。长期以来，坏死性肠炎的防控主要依赖于饲料中抗生素的添加，但随着饲用抗生素的禁用，该病在全球又呈现频发态势，每年给全球家禽养殖业带来巨大的经济损失。因此，探索新的抗生素替代物用以防控坏死性肠炎是家禽养殖业当前亟待解决的问题。
[0003]益生菌是指一类摄取一定数量时，能对宿主健康产生有益作用的活的微生物。益生菌具有多种生物活性，其可通过改变肠道酸碱环境，合成抗菌物质及竞争性粘附肠道上皮细胞等方式减少肠道内有害菌，如产气荚膜梭菌的数量，抑制有害菌的毒素合成。越来越多的研究结果表明，益生菌是预防产气荚膜梭菌感染的有效途径。罗伊氏黏液乳杆菌是动物肠道内少数几种原籍菌之一，有着良好的胃肠液耐受性和肠黏膜粘附能力。在厌氧条件下，罗伊氏黏液乳杆菌还可以甘油为底物，在胞内甘油脱水酶催化下产生的一类名为罗伊氏菌素的细菌素。该细菌素是一类以3
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羟基丙醛为主，同时含有3
‑<br/>羟基丙醛二聚体和3
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羟基丙醛水合物的非蛋白类广谱抗菌剂，对沙门氏菌、大肠肝菌、空肠弯曲杆菌、艰难梭菌等多种肠道致病菌均具有明显的抑菌杀菌功效，具有毒性低、安全范围广、且不产生细菌耐药性等优点，是一种天然的抗生素替代物。综上，罗伊氏黏液乳杆菌是理想的益生菌筛选和开发来源。然而，在目前公开的专利中，有关益生罗伊氏黏液乳杆菌的筛选及应用于拮抗产气荚膜梭菌的相关研究未见报道。

技术实现思路

[0004]本申请的专利技术人从健康肉鸡的盲肠内容物中筛选到了一株具有显著益生菌潜能的罗伊氏黏液乳杆菌。本专利技术人通过大量试验证实，该罗伊氏黏液乳杆菌对高温、人工胃液和肠液等均具有较高的耐受性且菌株肠上皮细胞粘附性良好，并且还具有突出的罗伊氏菌素合成能力，还对产气荚膜梭菌具有拮抗作用，并由此完成了本专利技术。
[0005]因此，在第一方面，本专利技术提供一种罗伊氏黏液乳杆菌，其命名为罗伊氏黏液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri LR21，该菌株于2022年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO:M 2022464，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
[0006]在本专利技术中，所述罗伊氏黏液乳杆菌LR21具有以下特征：（1）菌落形态：菌落呈圆形、乳白色、不透明，边缘整齐，表面隆起且湿润；（2）菌体形态：革兰氏阳性杆菌、两端钝圆、
有短杆、长杆形态，不产芽孢；（3）生长特点：兼性厌氧，液体MRS培养基培养4h后进入对数生长期，10h进入稳定期；生长过程中产生乳酸和二氧化碳；（4）罗伊氏黏液乳杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。将所测16S rDNA序列通过BLAST比对，鉴定其为罗伊氏黏液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）。
[0007]在本专利技术中，所述罗伊氏黏液乳杆菌LR21至少具有以下益生特性：（1）在pH2.5的人工胃液中处理3h，其存活率为97.75%；（2）在pH7.8的人工肠液中处理3h，其存活率为98.72%；（3）在75℃高温处理5min后，其活菌数维持在106CFU/mL；（4）体外上皮细胞模型中，乳酸菌处理3h后上皮细胞表面粘附的活菌数约为107CFU/mL，粘附率为77.19%。
[0008]在第二方面，提供了一种菌剂，其包含所述罗伊氏黏液乳杆菌。
[0009]在第三方面，提供了一种发酵剂，其包含所述罗伊氏黏液乳杆菌。
[0010]在某些实施方案中，所述发酵剂中包含罗伊氏菌素。
[0011]在某些实施方案中，所述发酵剂采用所述罗伊氏黏液乳杆菌对包含甘油的组合物进行发酵得到。
[0012]在某些实施方案中，所述组合物中还包括提供营养成分的固体或液体培养基。
[0013]在某些实施方案中，所述罗伊氏黏液乳杆菌或所述菌剂或所述发酵剂在制备用于抑制产气荚膜梭菌生长、生物膜形成和毒力基因表达的微生物添加剂中的应用。
[0014]在某些实施方案中，所述罗伊氏黏液乳杆菌或所述菌剂或所述发酵剂在制备用于饲料添加剂中的应用。
[0015]综上所述，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的罗伊氏黏液乳杆菌LR21对高温、人工胃液和肠液等均具有较高的耐受性且菌株肠上皮细胞粘附性良好，具有较强的抗逆性。
[0016]本专利技术供的罗伊氏黏液乳杆菌LR21具有突出的罗伊氏菌素合成能力，在发酵过程中产生的多种活性成分对产气荚膜梭菌的生长和毒素合成等有明显的抑制效果，具有开发成为新型预防产气荚膜梭菌感染的微生物添加剂的潜力。
附图说明
[0017]附图1为罗伊氏黏液乳杆菌菌落形态图。
[0018]附图2为罗伊氏黏液乳杆菌LR21发酵上清对产气荚膜梭菌的体外抑菌效果图。
[0019]附图3为3
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羟基丙醛和LR21甘油发酵上清液高效液相色谱图。图3A：3
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羟基丙醛标准品高效液相色谱图；图3B：LR21菌株的甘油发酵上清液的色谱图；图3C：硅胶柱层析后的LR21菌株甘油发酵上清液的色谱图。
[0020]附图4为LR21甘油发酵上清液对产气荚膜梭菌的体外抑菌效果图。
[0021]附图5为罗伊氏黏液乳杆菌LR21甘油发酵上清液对产气荚膜梭菌细胞形态的影响。图5A：未经处理的产气荚膜梭菌Cp 13124细胞形态图；图5B：1
×
MIC的LR21来源的罗伊氏菌素处理的Cp 13124细胞形态图；图5C：2
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MIC的LR21来源的罗伊氏菌素处理的Cp 13124细胞形态图。
[0022]附图6为罗伊氏黏液乳杆菌LR21甘油发酵上清液对产气荚膜梭菌生物膜形成的试验结果。
[0023]附图7为罗伊氏黏液乳杆菌LR21甘油发酵上清液对产气荚膜梭菌毒力基因表达的
试验结果。
[0024]附图8为体外培养条件下罗伊氏黏液乳杆菌LR21对产气荚膜梭菌生长的试验结果。图例中Cp为单独Cp 13124培养对照组；Co为LR21和Cp 13124菌液混合培养组；CG为LR21和Cp 13124混合培养且培养基额外添加250mM甘油组。
具体实施方式
[0025]实施例1.菌株的分离与鉴定本专利技术菌株分离自健康肉鸡的盲肠内容物，具体的分离筛选方法如下：取0.1g内容物加至1mL的0.01M灭菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种罗伊氏黏液乳杆菌，其特征在于，所述罗伊氏黏液乳杆菌为罗伊氏黏液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri LR21；该菌株于2022年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022464，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。2.一种菌剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的罗伊氏黏液乳杆菌。3.一种发酵剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的罗伊氏黏液乳杆菌。4.根据权利要求3所述的发酵剂，其特征在于，所述发酵剂中包含罗伊氏菌素。...

【专利技术属性】
技术研发人员：占秀安，徐义斌，丁小青，付爱坤，王园园，李丹蕾，梁霜，谢玲钰，张运锋，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：