缺血性脑卒中SEREX标志物的应用制造技术

本发明专利技术涉及分子医学技术领域，尤其涉及IPC C12Q1，更具体地，涉及缺血性脑卒中SEREX标志物的应用。本发明专利技术通过免疫筛选重组cDNA表达克隆筛选出PABPC1，然后通过生物信息技术进一步验证了PABPC1在缺血性脑卒中TIA和CI中的重要性，通过PABPC1在试剂盒中的相关应用，测定TIA和CI的疾病进程中PABPC1的含量，可以促进心脑血管相关疾病的预防与治疗。进心脑血管相关疾病的预防与治疗。

【技术实现步骤摘要】
缺血性脑卒中SEREX标志物的应用


[0001]本专利技术涉及分子医学
，尤其涉及IPC C12Q1，更具体地，涉及缺血性脑卒中SEREX标志物的应用。

技术介绍

[0002]脑梗死(cerebral infarction,CI)又称缺血性脑卒中，是临床常见病、多发病，致残率和病死率非常高。随着老龄化加重，我国每年因CI直接消耗的医疗支出和其他间接经济损失超过200亿元人民币，给社会发展带来沉重的经济负担，故CI的防治成为了医学界的重要课题。短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack,TIA)和CI同属于临床常见的神经系统高发缺血性脑血管病，发病率很高，大约占CI的40％以上。随着研究的逐步深入，目前普遍认为：TIA本身就是急性脑梗死(acute cerebral infarction,aCI)最重要的独立危险因素，如果能够尽早发现TIA并予以积极有效的治疗，无疑可以预防CI的发生，降低致残率和病死率。因此，CI的防治策略是早期预警TIA，在神经系统功能尚未发生不可逆损害之前及时干预。但是，TIA难于提前发现，如何在TIA发作前进行准确诊断，目前还有待继续探索。
[0003]近年来，随着基因组DNA测序技术的飞速发展，自身抗体也常被用于筛选重组cDNA基因表达文库，从而识别和分离目的抗原的cDNA单克隆。血清自身抗体的产生是由人体中某些免疫活性亚细胞颗粒的组成成分诱发的，这些亚细胞颗粒的组分涉及DNA的复制和转录、RNA的合成及细胞分裂等重要细胞功能，作为靶抗原在唤起自身抗体免疫应答过程中起着重要的作用。通过检测敏感性和特异性均较高的自身抗体，可以精确诊断自身免疫性疾病，并可作为治疗靶点和预后观测指标指导临床。
[0004]目前，实体活检作为诊断及治疗工具，比如手术摘除的器官、组织，穿刺抽取组织、自病变部位切取的小块组织，在临床上应用广泛。但，实体活检具有侵入性和空间异质性，且对于心脑血管疾病而言，使用时往往是患者已经处于疾病中晚期，不利于根治性治疗及提高生存率。而液体活检只是取用血液、尿液或其他体液样本进行检测疾病相关的标志物，快速、创伤较小并且具备预知性。液体活检对于肿瘤、心血管疾病等自身免疫病的早期诊断和预后已经受到越来越多的关注。
[0005]重组cDNA表达克隆的血清学鉴定技术(serological identification of antigens through recombinant cDNA expression cloning,SEREX)是在基因组规模上筛选与识别相关靶抗原基因,为疾病治疗提供分子靶位和实验依据的最方便、最有效的液体活检工具之一。它结合了血清免疫学表面展示技术和分子克隆技术，利用B淋巴细胞识别相关靶抗原，诱发体液免疫应答，从而检测特异性自身抗体。生物信息学分析可以利用人类基因组序列数据和相关分子和表型特征的大量纲要，以及基因组尺度表达，表观基因组学和其他功能基因组数据来了解变异影响，阐明失调基因对特定疾病和组织环境中生物途径的影响，并解释疾病风险。利用生物信息学分析了解到TIA和CI相关基因可参与多种途径，这些途径在不同生物学过程中起着关键作用。
[0006]现今医学界基于TIA防治的研究非常多，有鉴于影像学技术对TIA早期预警的局限性(影像学各种诊断手段均无法找到脑组织损害的证据)，多数研究主要着眼于TIA相关风险因素(risk factor)的认识和生物标记物(Biomarker)的识别。截至目前，已有多个生物标记物被相继发现：氧化修饰低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)、b2糖蛋白I(b2
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glycoprotein I)、热休克蛋白(heat shock proteins,Hsps)和谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)等，它们有助于辅助诊断脑血管疾病的发生，但独立对TIA的检出不敏感。
[0007]因此，识别新的更有价值的TIA生物标记物是临床亟待研究的问题。

技术实现思路

[0008]为了克服现有技术的不足，本专利技术第一方面提供了缺血性脑卒中SEREX标志物的应用，所述标志物的筛选方法，包括以下步骤：
[0009]免疫筛选重组cDNA表达克隆：
[0010]S1：提取XL1
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Blue菌株加入8～12mL LB培养基中，在恒温箱中培养备用。取人主动脉内皮细胞λZAPII噬菌体cDNA表达文库稀释液8～12μL与500～700μL XL1
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Blue 37℃混合孵育12～18min；加入7～8mL NZY Top Agar混匀平铺在35～40℃预热的NZY琼脂平板上，凝固后35～40℃倒置培养4～6h，培养至噬菌斑形成；
[0011]S2：将噬菌斑转印硝酸纤维素膜，经IPTG诱导cDNA蛋白表达后，与一次抗体共育，再用二次抗体孵育，最后通过显色反应观察一次抗体与膜上cDNA克隆表达蛋白是否发生血清学反应，挑取阳性克隆，并降低噬菌体滴度，再次扩增进行第二、三轮筛库以纯化得到抗原单克隆；
[0012]S3：配置阳性重组cDNAλZAPII噬菌体和辅助噬菌体的混合液，加热孵育裂解λZAPII噬菌体和XL1
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Blue，离心收集噬菌体，转染菌株，铺平板37℃倒置过夜；经卡那霉素筛选获得转化的阳性克隆pBluescript质粒；挑取单个菌落扩增、保种及小量质粒提取；
[0013]S4：经双酶切鉴定后对搭载cDNA片段(阳性克隆)的pBluescript质粒进行DNA测序；
[0014]S5：利用美国国家生物技术信息中心互联网公开的生物信息学资源：参考序列数据库(RefSeq Database)，使用NCBI
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BLAST检索工具，将测得的DNA序列与已知基因序列进行同源性检索与分析，从而获得目的基因序列的生物学信息；所述标志物为目的基因；所述目的基因包括PABPC1；所述标志物为非疾病诊断用途。
[0015]优选地，所述XL1
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Blue细胞购自美国Stratagene公司。
[0016]优选地，所述S1步骤中LB培养基为含0.2％(w/v)麦芽糖，10mM MgSO4，12.5g/L四环素的LB培养基。
[0017]优选地，所述S1步骤中恒温箱的温度为28～32℃，离心速度为200～220r/min。
[0018]优选地，所述人主动脉内皮细胞λZAPII噬菌体cDNA表达文库购自美国Stratagene公司。
[0019]优选地，所述S1步骤中λZAPII噬菌体的滴度大于5
×
105pfu/mL；进一步优选地，为6.7
×
105pfu/mL。
[0020]本专利技术中，通过滴定稀释重组噬菌体克隆，对噬菌斑形成单位计数，可计算cDNA表
达文库的滴度，进而确定合适的噬菌体浓度，以提高阳性克隆的筛选精本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.缺血性脑卒中SEREX标志物的应用，其特征在于，所述标志物的筛选方法，包括以下步骤：S1：提取XL1
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Blue菌株加入8～12mLLB培养基中，在恒温箱中培养备用。取人主动脉内皮细胞λZAPII噬菌体cDNA表达文库稀释液8～12μL与500～700μL XL1
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Blue 37℃混合孵育12～18min；加入7～8mL NZY Top Agar混匀平铺在35～40℃预热的NZY琼脂平板上，凝固后35～40℃倒置培养4～6h，培养至噬菌斑形成；S2：将噬菌斑转印硝酸纤维素膜，经IPTG诱导cDNA蛋白表达后，与一次抗体共育，再用二次抗体孵育，最后通过显色反应观察一次抗体与膜上cDNA克隆表达蛋白是否发生血清学反应，挑取阳性克隆，并降低噬菌体滴度，再次扩增进行第二、三轮筛库以纯化得到抗原单克隆；S3：配置阳性重组cDNAλZAPII噬菌体和辅助噬菌体的混合液，加热孵育裂解λZAPII噬菌体和XL1
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Blue，离心收集噬菌体，转染菌株，铺平板37℃倒置过夜；经卡那霉素筛选获得转化的阳性克隆pBluescript质粒；挑取单个菌落扩增、保种及小量质粒提取；S4：经双酶切鉴定后对搭载cDNA片段的pBluescript质粒进行DNA测序；S5：利用美国国家生物技术信息中心互联网公开的生物信息学资源：参考序列数据库RefSeq Database，使用NCBI
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BLAST检索工具，将测得的DNA序列与已知基因序列进行同源性检索与分析，获得目的基因序列的生物学信息；所述标志物为目...

【专利技术属性】
技术研发人员：王昊，杨万勇，徐安定，林苗，沈思，
申请(专利权)人：暨南大学附属第一医院广州华侨医院，
类型：发明
国别省市：