基于三螺旋二价适配体和纳米酶的啶虫脒侧向流动分析方法和试纸技术

本发明专利技术公开了基于三螺旋二价适配体和纳米酶的啶虫脒侧向流动分析方法和试纸，属于分析化学、医药、环境、食品安全检测和纳米生物传感等领域。通过构建三螺旋二价适配体，极大提高了适配体与靶标的结合速率，响应时间缩短为常规适配体的1/6倍；借助Au@Pt纳米酶出色的类过氧化物酶活性，使得Apt

【技术实现步骤摘要】
基于三螺旋二价适配体和纳米酶的啶虫脒侧向流动分析方法和试纸


[0001]本专利技术涉及基于三螺旋二价适配体和纳米酶的啶虫脒侧向流动分析方法和试纸，属于分析化学、医药、环境、食品安全检测和纳米生物传感等领域。

技术介绍

[0002]侧流层析分析(LFA)技术是一种广泛使用的纸基生物传感检测平台，可以在几分钟内获得测试结果，而无需训练有素的人员操作昂贵且精密的仪器。因此，它以成本低、操作简单、检测速度快等优点引起了研究人员的广泛关注，侧流层析分析技术已被大量用于现场检测，并广泛应用于各种领域，包括生物医学、食品安全、质量控制以及环境卫生。识别元件是LFA的关键组成部分之一，长期以来，针对小分子化合物的LFA一直依赖抗体。然而，抗体的应用受到多种因素的阻碍，例如不可逆的温度诱导变性、制备时间延长、化学修饰可控性差。如今，通过SELEX的体外迭代过程筛选的核酸适配体有望被利用来克服这些限制。
[0003]LFA技术主要包括竞争型、夹心型和吸附解吸型。对于低分子量的化合物(如真菌毒素等)的检测中通常采用的是竞争型。目前主要有两种类型的竞争性测定，一种是基于与适配体部分互补的寡核苷酸与靶标竞争适配体的结合；另一种是样品溶液中的靶标与固定在测试区的靶标竞争适配体结合的侧向层析试纸技术。基于互补序列与靶标竞争的模式应用更多。
[0004]核酸适配体由于其独特的性能，一直是分析化学等领域研究的重点。尽管已经证明其在生物传感方面拥有巨大的应用潜力，但很少有人关注适配体传感器响应速率的提高，而这是适配体传感器实际应用的一项重要性能指标。迄今为止，大部分基于适配体的传感器都存在一个比较明显的缺点，就是响应时间长。在文献(Analytical Chemistry，2013，85(17):8397
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8402.)中，适配体需要3h的孵育时间才能在基于目标诱导链置换的适配体传感器中实现最佳的信号灵敏度。适配体呈现相对敏感和柔性的构象，对环境敏感不稳定的构象也是实现快速响应的障碍。目前已经实施了几种策略来优化适配体，例如在文献(Toxicon，2015，101:41
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47.)中，采用了化学改性的方法；在文献(Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，2009，19(23):6585
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6587)中采用了长度截断和诱变的方法；在文献(Biosensors and Bioelectronics，2018，103:39
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44)中通过多价效应和协同结合优化核酸适配体，多个结合基序同时结合到多个靶标，减少脱靶效应，显著增强了结合的亲和力。适配体的结合相互作用可以用最小化它们的结构灵活性来加强。目标结合亲和力由它们自适应折叠成独特的3D结构来确定。虽然适配体在与靶标结合时应具有一定程度的柔韧性以发生构象变化，但适配体的过度柔韧性阻碍了折叠过程。在文献(Journal of the American Chemical Society，2012，134(49):19957
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19960)中是用三螺旋固定适配体末端的策略限制了适配体的灵活性并且增加对蛋白分子的结合力；在文献(Journal of the American Chemical Society，2019，141(44):17493
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17497)中合成了三螺旋DNA，相比原始适配体，其亲和力提高了10倍，末端固定的三螺旋结构已被证明可以通过稳定构象结构增
强适配体的靶标结合力。
[0005]检测灵敏度对侧向层析技术的实际应用起到重要影响。酶催化增强型侧向层析试纸技术是在正常测定后在测试区域滴加显色试剂可用于放大比色对比度的方法。在文献(Biosensors&Bioelectronics,2019,142:111498)中设计了基于铂纳米粒子锚定的氢氧化镍纳米材料(Pt
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Ni(OH)2NSs)的双向免疫层析方法。由于Pt
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Ni(OH)2NSs具有很强的类过氧化物酶活性，在滴加显色底物后检测信号显著增强，该方法可以同时实现对乙草胺和甲氰菊酯的低检测限检测；在文献(Biosensors&Bioelectronics,2020,169:112610)中建立了磁性普鲁士蓝纳米酶(MPBN)介导的克伦特罗和莱克多巴胺的免疫层析检测技术(MLFIA)。利用MPBN的过氧化物酶活性，在引入显色底物后实现了检测信号的增强，同时也拓宽了检测范围。使用纳米酶侧向层析分析试纸针对小分子化合物的检测，有的可以提高靶标检测的灵敏度，也有的能够拓宽检测范围，但同时提升两种特性的方法少见报道。
[0006]总的来说，因核酸适配体对环境敏感的构象，均需要较长时间实现对靶标的响应，这限制了适配体LFA的快速发展。相对大量的小分子抗体LFA方法，适配体LFA方法还非常少。同时，Au NPs为标记物的LFA的检测方法的灵敏度仍然偏低，限制了该方法在超低检测限的场景中的应用。因此，开发同时提升两方面的性能的新型适配体LFA方法和试纸，具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0007][技术问题][0008]现有核酸适配体传感方法，通常需要较长时间实现对靶标的响应，限制了适配体侧向层析分析(LFA)试纸的发展，尤其是对小分子化合物的快速检测应用。纳米酶标记核酸链用于LFA的方法的信号放大还比较少。
[0009][技术方案][0010]本专利技术所采用的纳米金铂粒子(Au@PtNPs)是参考文献(Talanta，2021，225:121961)中种子介导的方法制备，首先制备了金纳米粒子(AuNPs)，将制备的Au NPs溶液作为种子，在Au NPs的表面上生长Pt壳制备纳米金铂粒子。
[0011]本专利技术采用polyA
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cDNA作为探针，该探针采用polyA作为锚定块，将polyA
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cDNA锚定在纳米金铂粒子上制备得到Au@PtNPs@polyA
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cDNA偶联物。核酸试纸条的检测区域(T线)喷涂链霉亲和素(SA)，控制区域(C线)喷涂与Au@Pt NPs@polyA
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DNA偶联物的PolyA
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cDNA部分互补的寡核酸链(SA
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Bio
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DNAc)，构建了通用型的纳米酶标记核酸试纸条。该试纸条在T线喷涂的SA，以及在C线喷涂的SA
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Bio
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DNAc无需改变，仅改变polyA
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cDNA上与适配体互补的部分，即可检测另一种物质，为以后的检测提供了方便。
[0012]本专利技术所使用的三螺旋二价适配体上有10个碱基与金铂纳米探针(Au@PtNPs@PolyA
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cDNA)互补。生物素化的三螺旋二价适配体与纳米探针结合后，Au@Pt NPs探针可被T线上的SA捕获。当存在小分子物质时，小分子物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测啶虫脒的三螺旋二价适配体，其特征在于，所述三螺旋二价适配体由2条相同的单价适配体和桥核酸链组成；所述单价适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述PolyA桥核酸链的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。2.一种检测啶虫脒的侧向层析试纸条，其特征在于，所述侧向层析试纸条含有权利要求1所述三螺旋二价适配体、纳米金铂粒子、探针polyA
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cDNA和链霉亲和素
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生物素
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DNAc；所述探针polyA
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cDNA含有polyA片段、与DNAc互补的片段和与小分子物质的核酸适配体互补的片段；所述三螺旋二价适配体的5
’
端经生物素标记；所述链霉亲和素
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生物素
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DNAc是将链霉亲和素与5
’
端经生物素标记的DNAc等体积混合，在3～5℃孵育2～4h制备得到的。3.根据权利要求2所述的侧向层析试纸条，其特征在于，所述DNAc的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针polyA
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cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求2所述的侧向层析试纸条，其特征在于，所述链霉亲和素浓度为2.0～3.0mg/mL，所述DNAc浓度为240～260μM。5.根据权利要求2所述的侧向层析试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC胶板；所述PVC底板上依次黏贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭池方，李国文，李秀萍，毛民欣，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：