一种Halo-tag标记和3D超分辨成像观察植物活细胞核蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种Halo

【技术实现步骤摘要】
一种Halo
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tag标记和3D超分辨成像观察植物活细胞核蛋白的方法


[0001]本专利技术属于分子标记技术和显微成像
，尤其涉及一种Halo
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tag标记和3D超分辨成像观察植物活细胞核蛋白的方法。

技术介绍

[0002]植物的原生质体细胞指的是去除细胞壁之后的所有内含物，它既保持了植物细胞的一切生理活性，并且还排除了较厚细胞壁的存在和干扰，在分子标记和光学成像研究方面，具有和动物细胞类似的优势，可以迅速进行反应、代谢和表达，极大地缩短了实验周期，并能获得可靠的活体实验数据，因此目前被广泛应用于植物细胞生物学的研究中。新型Halo
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tag标记技术是指Halo
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tag蛋白和外源Halo
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tag配基之间共价结合的化学反应，它允许研究人员通过基因工程对目标分子进行特异性标记，同时还能根据实验目的需要，来添加含有不同功能基团的Halo
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tag配基。Halo
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tag标记技术克服了传统分子标记的局限性，反应十分迅速，实验简单只需要构建单一载体，就能实现多种实验目的，还可以与不同的超分辨显微成像系统、以及其他标记技术进行联合应用，因此该技术在细胞生物学中有着广泛的应用。
[0003]以往开展活体状态下的细胞结构和功能研究，主要是利用传统荧光蛋白(GFP/mCherry)、有机染料或者量子点标记的方法，然而这些标记方法具有非常容易漂泊、发射光谱较宽且特异性差等缺点，限制了它们在活细胞超分辨成像领域中的应用，更不能精确的反映真实状态下分子的结构和分布特征，因此也就阻碍了细胞核内单分子的超分辨结构和功能机理的深入探索和研究。
[0004]已有报道通过对烟草和杨树的原生质体作为研究对象，以Halo
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tag标记技术作为手段来研究分子的定位情况，但尚未扩展到活细胞超分辨成像领域，并且也没有利用模式植物拟南芥为研究对象的工作，更没有在单分子水平上进行定量分析目标蛋白的精细结构和分布特征。因此，现有技术中缺少一种利用模式植物拟南芥原生质体作为研究对象，利用Halo
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tag技术来快速对活细胞核内目标分子进行特异标记的方法，尤其是缺少结合3D超高分辨成像系统来对核内蛋白的结构、定位和分布进行精细观察的方法。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种利用新型Halo
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tag标记和3D超分辨成像技术观察植物活细胞核蛋白的方法，能够长时间、实时多角度成像和定量分析植物活细胞核蛋白的定位特征、精细结构特点和荧光强度分布。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种Halo
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tag标记和3D超分辨成像观察植物活细胞核蛋白的方法，包括如下步骤：步骤一：获取Halo
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tag转基因植株；步骤二：制备和培养植物原生质体细胞；步骤三：Halo
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tag荧光染料的孵育和漂洗；步骤四：3D
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SIM超分辨成像观察；步骤五：利用软
件分析图像和统计相关参数。
[0008]优选的，所述步骤一具体为：将Halo
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tag基因序列连接到带有目的基因的真核表达载体pCAMBIA2300
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目的基因中，获得pCAMBIA2300
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目的基因
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Halotag，将pCAMBIA2300
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目的基因
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Halotag侵染进入植物中，获得带有Halo
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tag标签的转基因植株。
[0009]优选的，所述目的基因包括MED18。
[0010]优选的，所述Halo
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tag基因序列是以pH6HTNT7载体为模板，PCR扩增获得。
[0011]优选的，所述步骤二中培养植物原生质体细胞具体为：恒温避光培养。
[0012]优选的，所述步骤三中孵育具体为：利用Halo
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tagTMR荧光染料进行染色，混匀后，避光28
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37℃孵育15
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60min。
[0013]优选的，所述步骤三中漂洗具体为：采用干净培养基清洗后，避光条件下采用脱色摇床孵育，所述脱色摇床的转速为40rpm
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45rpm。
[0014]优选的，所述步骤四具体为：对标记后的原生质体细胞核使用DAPI荧光染料进行染色，洗涤后使用结构光超分辨显微镜，用3D成像模式，调整激光强度为4
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6％、曝光时间在60ms以下，选取405和568nm双通道激发光对染色后的原生质体进行观察。
[0015]优选的，所述步骤五具体为：对获得的超分辨图像，利用ImageJ、Imaris、Origin和Prism 8软件提取获得的参数信息，根据目标分子的大小建立单分子的模拟斑点和量化分析，进一步展示活细胞核内目标分子的特异性结构特点和分布特征信息。
[0016]优选的，所述植物包括拟南芥、烟草和杨树。
[0017]本专利技术的有益效果：
[0018]本专利技术采用了新型Halo
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tag标记方法，既能保证遗传标记的特异性，还能保持有机染料能发射更多光子数的优势，最主要是Halo
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tag蛋白与Halo
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tag荧光配基之间是共价结合的有机反应，保证了有机染料结合的稳定和不可逆性，本专利技术方法可以长时间的、特异性的标记植物细胞核内蛋白质，抗猝灭和漂白能力大大提高，并且标记过程非常十分简单和快速。
[0019]本专利技术采用了DeltaVision OMX结构光照明的超高分辨率显微成像系统，其中选择3D成像模式，通过记录3个角度、5个相位，设置0.125μm的间隔，拍摄1μm厚度，共135张原始图像，最终通过不同的算法重构出SIM超分辨成像图片，从而实现植物细胞核内的目标分子的长时间追踪和精细定位观察。
[0020]本专利技术标记和成像方法是首次在模式植物拟南芥活细胞样品中实现，能够在活体条件下，真实地反应单个分子的分布和结构特点，并最终获得植物细胞核内的单分子超高分辨图像。
[0021]本专利技术方法利用四种不同的软件，分别进行图像的处理、模拟、数据的分析和拟合，来精确地识别细胞核内单分子的特征，并从多个不同的角度、进一步量化目标分子的精细结构和分布特征。
[0022]本专利技术方法重复性高，操作简单，并在不同植物物种间广泛适用，为活体状态下单分子水平的时空特异超分辨成像研究提供了一种快速的方法。
附图说明
[0023]图1是本专利技术方法的实验流程图；
[0024]图2是本专利技术的标记和成像原生质体细胞核的宽场荧光图像；
[0025]图3是本专利技术通过3D超分辨显微镜观察原生质体核蛋白的动态效果图像；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Halo
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tag标记和3D超分辨成像观察植物活细胞核蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：获取Halo
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tag转基因植株；步骤二：制备和培养植物原生质体细胞；步骤三：Halo
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tag荧光染料的孵育和漂洗；步骤四：3D
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SIM超分辨成像观察；步骤五：利用软件分析图像和统计相关参数。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一具体为：将Halo
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tag基因序列连接到带有目的基因的真核表达载体pCAMBIA2300
‑
目的基因中，获得pCAMBIA2300
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目的基因
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Halotag，将pCAMBIA2300
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目的基因
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Halotag侵染进入植物中，获得带有Halo
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tag标签的转基因植株。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目的基因包括MED18。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Halo
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tag基因序列是以pH6HTNT7载体为模板，PCR扩增获得。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：林金星，钱虹萍，崔亚宁，张原，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：