原发性膜性肾病诊断试剂盒的研发与应用制造技术

本发明专利技术公开了原发性膜性肾病诊断试剂盒的研发与应用，诊断试剂盒由诊断玻片(携带有Pla2r和Thsd7a过表达质粒的293T细胞玻片)、洗涤液、工作液、抗体孵育液等试剂耗材组成。本发明专利技术基于CBA方法，体外构建脱髓鞘疾病诊断而种血清学标志物(Pla2r和Thsd7a)质粒，转染胎肾上皮293细胞，组合表达不同标志物的细胞，以患者血清为靶的，通过细胞免疫荧光染色技术，实现对脱髓鞘疾病的联合诊断；产品具有灵敏性高(80.2％

【技术实现步骤摘要】
原发性膜性肾病诊断试剂盒的研发与应用


[0001]本专利技术涉及基因药物研发
，尤其涉及原发性膜性肾病诊断试剂盒的研发与应用。

技术介绍

[0002]原发性模性肾病(Primary Membranous nephropathy,PMN)是肾病综合征中常见的病理类型之一，病理表现为免疫复合物在肾脏组织内大量沉积以及补体增高引起的蛋白尿，是导致成年人肾病综合征的常见肾小球疾病。国外报道显示，PMN占成年人原发性肾病综合征病例的20％
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40％。近年来，我国肾病的疾病谱发生明显变化，MN的发病率呈快速上升趋势，PMN的发病率由1997
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2007年的15％上升至2014年的30
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40％。PMN具有与其他肾脏疾病(PMN)相似的临床特征，且病理标志物呈多样性；容易造成误诊进一步导致治疗无效性。因此研发简单高效的PMN疾病诊断方法具有十分重要的临床意义。
[0003]肾脏活检学是PMN常用的诊断方法，病理学能分析病灶数量和大小，但无法实现疾病的亚型分类及早期诊断，且存在潜在安全风险、检测费用昂贵、取材不便等问题；且无法实现疾病亚型分类。近年来研究显示PMN病人血清Pla2r和Thsd7a自身抗体表达水平与疾病呈显著的相关性。针对1551例PMN患者的Meta分析显示，抗Pla2r血清自身抗体检测对于PMN的敏感性接近70％，特异性达到95％以上。2014年的研究发现抗Pla2r抗体阴性的PMN患者血清中存在Thsd7a，从而实现Pla2r和Thsd7a两项自身抗体对PMN的联合诊断效果。血清学IgG抗体检测具有经济、高效、检测便捷等优点，是肾脏活检学诊断有效的替代方法。。
[0004]但是常见的血清学Ig(G)抗体检测包括放射免疫沉淀法(RIPA)、间接细胞免疫荧光法(IFA)、酶联免疫吸附法(Elisa)等，但这些方法在临床使用中存在特异性差(Elisa)、检测效率低(IFA)以及安全隐患(RIPA)、灵敏度低等问题。

技术实现思路

[0005]1.要解决的技术问题
[0006]本专利技术的目的是为了解决现有方法在临床使用中存在特异性差(Elisa)、检测效率低(IFA)以及安全隐患(RIPA)、灵敏度低的问题，而提出的原发性膜性肾病诊断试剂盒的研发与应用。
[0007]2.技术方案
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0009]原发性膜性肾病诊断试剂盒，包括诊断玻片、洗涤液、工作液和抗体孵育液。
[0010]优选地，所述诊断玻片为携带有Pla2r和Thsd7a过表达质粒的293T细胞玻片。
[0011]本专利技术还提出了原发性膜性肾病诊断试剂盒的研发，包括以下步骤：
[0012]步骤1：Pla2r和Thsd7a表达质粒的构建及质粒提取，通过常规分子生物学方法构建Pla2r和Thsd7a过表达质粒；
[0013]步骤2：Pla2r和Thsd7a表达质粒转染293T细胞，常规方法培养HEK293T细胞，将
pDC315
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Pla2r
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Flag和pDC315
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Thsd7a
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Flag过表达质粒连同Lipofactamine3000形成转染复合物，转染293T细胞；于转染后24、36、以及48小时固定细胞，Flag抗体免疫荧光染色，荧光显微镜下通过Flag表达比率确定转染效率；并通过荧光定量PCR和Westernblot验证表达强度；
[0014]步骤3：诊断试剂盒的设计、长期稳定性测试及长期稳定保存；
[0015]步骤4：PMN检测试剂盒的临床验证及评估体系的建立。
[0016]优选地，所述步骤1中构建Pla2r和Thsd7a过表达质粒的主要包括以下步骤。
[0017]优选地，所述步骤1中构建Pla2r和Thsd7a过表达质粒的主要包括以下步骤：
[0018]S1：以pDC315
‑
Flag表达质粒为模板，设计携带有质粒酶切位点的引物，从PubmedNucleotide数据库中检索针对目的基因的CDS序列，通过PCR方法扩增TGF
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β1的cDNA；
[0019]S2：并将携带有质粒酶切位点的Pla2r和Thsd7acDNAPCR产物连接入pDC315
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Flag质粒，测序鉴定得到pDC315
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Pla2r
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Flag和pDC315
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Thsd7a
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Flag过表达质粒；
[0020]S3：大肠杆菌感受态细胞，质粒转化及提取。
[0021]优选地，所述步骤2中选择转染效率较高、激活水平显著提高的转染方法进行后续实验。
[0022]优选地，所述步骤3中建立包括细胞固定、透膜、封闭、一抗孵育和二抗孵育在内的一系列细胞免疫荧光染色技术；根据免疫荧光效率优化完善免疫荧光技术；通过模拟运算、不同温度保持、振荡等方法测试产品的稳定性；同时通过添加保护剂、真空包装等方法测试建立产品的长期保持方法。
[0023]优选地，所述步骤4中收集至少PMN和非PMN病人血清100例，采用Pla2r和Thsd7a诊断试剂盒临床试验PMN疾病的诊断情况，包括特异性、敏感性、抗体滴度等；结合临床症状及肾脏活检优化、确定诊断效率和有效性。
[0024]本专利技术还提出了原发性膜性肾病诊断试剂盒的应用，应用于原发性膜性肾病阳性样本的临床检测。
[0025]3.有益效果
[0026]相比于现有技术，本专利技术的优点在于：
[0027](1)本专利技术中，基于CBA方法，体外构建脱髓鞘疾病诊断而种血清学标志物(Pla2r和Thsd7a)质粒，转染胎肾上皮293细胞，组合表达不同标志物的细胞，以患者血清为靶的，通过细胞免疫荧光染色技术，实现对脱髓鞘疾病的联合诊断。
[0028](2)本专利技术中，产品具有灵敏性高(80.2％
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91.0％)、特异性强(100％)、经济性好、检测方法简单高效等优点；同时该产品通过对不同标志物联合检测，可实现对PMN疾病的快速诊断及疾病分类；有助于PMN疾病的早期筛查、诊断、预后评估、及临床用药。
附图说明
[0029]图1为本专利技术中原发性膜性肾病诊断试剂盒的研发的技术路线图；
[0030]图2为本专利技术中临床阳性样本的PLA2R检测结果图，绿色为Flag标签蛋白，红色IgG为PLA2R的IgG抗体；
[0031]图3为本专利技术中临床阳性样本的Thsd7a检测结果图，绿色为Flag标签蛋白，红色
IgG为Thsd7a的IgG抗体；
[0032]图4为本专利技术中样品的初步设计图。
具体实施方式
[0033]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.原发性膜性肾病诊断试剂盒，其特征在于，包括诊断玻片、洗涤液、工作液和抗体孵育液。2.根据权利要求1所述的原发性膜性肾病诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断玻片为携带有Pla2r和Thsd7a过表达质粒的293T细胞玻片。3.根据权利要求1
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2任一所述的原发性膜性肾病诊断试剂盒的研发，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：Pla2r和Thsd7a表达质粒的构建及质粒提取，通过常规分子生物学方法构建Pla2r和Thsd7a过表达质粒；步骤2：Pla2r和Thsd7a表达质粒转染293T细胞，常规方法培养HEK293T细胞，将pDC315
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Pla2r
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Flag和pDC315
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Thsd7a
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Flag过表达质粒连同Lipofactamine3000形成转染复合物，转染293T细胞；于转染后24、36、以及48小时固定细胞，Flag抗体免疫荧光染色，荧光显微镜下通过Flag表达比率确定转染效率；并通过荧光定量PCR和Westernblot验证表达强度；步骤3：诊断试剂盒的设计、长期稳定性测试及长期稳定保存；步骤4：PMN检测试剂盒的临床验证及评估体系的建立。4.根据权利要求3所述的原发性膜性肾病诊断试剂盒的研发，其特征在于，所述步骤1中构建Pla2r和Thsd7a过表达质粒的主要包括以下步骤：S1：以pDC315
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Flag表达质粒为模板，设计携带有质粒酶切位点的引物，从PubmedNucleotide数...

【专利技术属性】
技术研发人员：金立方，傅国权，闫俊艳，高悦，谢伊霞，
申请(专利权)人：浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：