一种I型内含子核酶、其制备方法和在调控RNA成环中的应用技术

本发明专利技术提供了一种I型内含子核酶、其制备方法和在调控RNA成环中的应用。该环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID1所示。本发明专利技术提供的I型反式内含子自剪接型核酶短小精湛，体外成环方法简单，成环效率高，所形成的环不引入额外核苷酸，在室温下能够长时间稳定存在。所形成的环在各种真核细胞内均能被高效转染，从而有效且便捷的用于外源性蛋白表达或者发挥miRNA调控、蛋白调控等ncRNA的功能。白调控等ncRNA的功能。

【技术实现步骤摘要】
一种I型内含子核酶、其制备方法和在调控RNA成环中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种I型内含子核酶、其制备方法和在调控RNA成环中的应用。

技术介绍

[0002]CircRNAs(Circular RNAs，环形RNA分子)是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的RNA分子。CircRNA来源于基因的外显子或者内含子区域，在哺乳动物细胞中大量存在。天然存在的circRNA由特殊的可变剪切产生，大量存在于真核细胞的细胞质中，但少部分内含子来源的circRNA则存在于核酸内，具有一定的组织、时序和疾病特异性。研究表明，circRNA广泛存在于人体细胞中，有时甚至超过它们线性异构体的10倍之多，与传统的线型RNA(linear RNA，含5
’
和3
’
末端)不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不易被核酸外切酶RNaseR降解，比线性RNA更稳定。目前发现的天然circRNA具有高度保守性，部分具有快速的进化性改变；大多数来源于外显子，少部分由内含子直接环化形成。此外，部分circRNA分子含miRNA应答元件(miRNAresponse element，MRE)，可充当竞争性内源RNA(competing endogenousRNA，ceRNA)，与miRNA结合，在细胞中起到miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达水平。部分circRNA可以翻译成蛋白质，大部分是非编码RNA。r/>[0003]CircRNA的环状结构能抵抗RNase R的降解而比较稳定，同时，由于其表达的特异性和调控的复杂性，以及在疾病发生中的重要作用，circRNA已经成为RNA领域的一个研究热点。目前circRNA常用体外成环方式主要有两种：T4 RNA连接酶连接成环，以及I型内含子自剪接成环。采用T4 RNA连接酶法进行连接时，其中一种方式是通过对待成环的核苷酸序列进行二级结构分析，根据分析结果，设计切割位点后加入T4 RNA连接酶进行连接。此种环化方式高度依赖线性化RNA的二级结构，成环效率低。为提高T4 RNA连接酶的circRNA成环效率，通常会加入与线性RNA末端互补的夹板，拉进两个末端距离，使之形成切口，便于T4 RNA连接酶进行连接。但此种成环方式常伴随着其他的分子间的连接反应，反应副产物较多，目标环状RNA的产量降低，同时造成后续纯化回收过程更加繁琐。由于加入夹板链后，夹板链与线性RNA链所形成的中间体不稳定，此种方法很难制备较小的环。此外，目前用于circRNA自剪接成环的I型内含子核酶为T4 bacteriophage或Anabeana的核酶。此类核酶在成环时均需要在线性RNA的两段分别添加5
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或者3
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exon fragment and spacer用于辅助两类核酶成环，这两类核酶在辅助线性RNA成环后，会分别引入74和138nt的核苷酸。额外引入的寡核苷酸会改变环状RNA的折叠构象，例如，会和环状RNA内部的核苷酸序列配对，或所额外引物的外源序列自身形成稳定的双链结构，最终造成将环状RNA转入细胞后所引起的天然免疫反应。因此，亟需一种能够在不额外引入核苷酸的前提下，广谱高效的circRNA体外成环制备方法。

技术实现思路

[0004]针对上述采用T4 RNA连接酶法体外制备环状RNA存在的环状RNA产率低、或需要借助夹板链，副产物繁多，后期纯化处理手段繁琐，以及采用某些I型内含子自剪接核酶导致的额外引入寡核苷酸，导致细胞内天然免疫反应的问题，本专利技术提供了一种I型内含子核酶、其制备方法和在调控RNA成环中的应用。采用该I型内含子核酶体外制备环状RNA的制备时，制备方法简单，制备效率高，不额外引入除目标序列之外的多余核苷酸，从而实现环状RNA能够被在体外高效制备，同时不引起细胞内天然免疫反应的目的。
[0005]本专利技术提供一种I型内含子核酶，其为1)～3)中任意一种：
[0006]1)核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的核酸；
[0007]2)在SEQ ID No.1所示的核酸中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且与SEQ ID No.1所示的核酸的调控功能相同或相似的核酸；
[0008]3)与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少60％同源性的核酸。
[0009]本专利技术提供的I型内含子自剪接核酶，其核苷酸长度为387bp，序列如SEQ ID No.1所示，其上游识别位点为U
‑
G不配对碱基对，下游识别位点为T。所述I型自剪接核酶还可以是与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列相似性大于60％的核苷酸序列，包括但不限于插入、缺失、重复以及除核心序列外添加额外的序列。
[0010]本专利技术还提供了编码所述的I型内含子核酶的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
[0011]为了有效地促进RNA成环，本专利技术对所述核酶进行了进一步的改造，提供一种包含所述I型内含子核酶的DNA片段的DNA表达框。所述DNA表达框从5
’
端到3
’
端依次包括反义核酸序列(记为anti
‑
sense region)、IGS序列、本专利技术I型内含子核酶、目的靶标序列和anti
‑
sense region的反向互补链，命名为anti
‑
sense region
‑
IGS
‑
I型内含子核酶
‑
target ORF
‑
anti
‑
sense region的反向互补链。
[0012]所述IGS序列从5
’
端到3
’
端依次包括：与目的靶标序列的5
’
末端部分碱基反向互补的序列、固定序列和与目的靶标序列的3
’
末端部分碱基反向互补的序列；
[0013]所述固定序列为碱基G；
[0014]所述反义核酸序列由20～80个碱基随机组成。
[0015]本专利技术中，目的靶标序列为编码待成环RNA序列的DNA序列。
[0016]本专利技术中，所述anti
‑
sense region序列(即反义核酸序列)优选为由40～50个碱基随机组成。所述anti
‑
sense region序列与IGS序列之间还包括随机序列1，所述随机序列1由1～20个碱基随机组成，优选为由4～10个碱基随机组成。所述IGS序列的长度为8
‑
30bp，优选为13bp；所述与目的靶标序列的5
’
末端部分碱基反向互补的序列的长度为3～15bp，优选为5
‑
10bp，更优选为7bp；所述固定序列为G；所述与目的靶标序列的3
’
末端部分碱基反向互补的序列的长度为3～20bp,优选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种I型内含子核酶，其特征在于，其为1)～3)中任意一种：1)核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的核酸；2)在SEQ ID No.1所示的核酸中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且与SEQ ID No.1所示的核酸的调控功能相同或相似的核酸；3)与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少60％同源性的核酸。2.编码所述的I型内含子核酶的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。3.DNA表达框，其特征在于，从5
’
端到3
’
端依次包括反义核酸序列、IGS序列、权利要求2所述的DNA片段、目的靶标序列和anti
‑
sense region的反向互补链；所述IGS序列从5
’
端到3
’
端依次包括：与目的靶标序列的5
’
末端部分碱基反向互补的序列、固定序列和与目的靶标序列的3
’
末端部分碱基反向互补的序列；所述固定序列为碱基G；所述反义核酸序列由20～80个碱基随机组成。4.根据权利要求3所述的DNA表达框，其特征在于，所述反义核酸序列和IGS序列之间还包括随机序列1，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖飞，邹丽辉，吴萌，张兰馨，蒋琳，
申请(专利权)人：瑞思高科生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：