一种来源于杨树的根特异启动子及其应用制造技术

本发明专利技术属于植物启动子技术领域，公开了一种来源于杨树的根特异启动子及其应用，该根特异性启动子的序列如SEQ ID NO.1所示，基于该特异性启动子构建的重组表达载体、重组菌能够用于在启动目的基因在植物的根部特异表达且在其他组织中不表达，故其在植物新品种培育、植物土壤修复等领域具有巨大的应用潜力。植物土壤修复等领域具有巨大的应用潜力。植物土壤修复等领域具有巨大的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种来源于杨树的根特异启动子及其应用


[0001]本专利技术属于植物启动子
，具体涉及一种来源于杨树的根特异启动子及其应用。

技术介绍

[0002]基因表达的调控发生在基因转录水平到翻译后修饰的不同层次阶段及多个阶段，其中RNA转录的开始是最重要的。基因转录起始位点上游包含顺式作用元件的DNA序列被称作为启动子，在转录水平上是一个重要的调控元件。启动子是RNA聚合酶识别、结合的位点，驱动转录的起始，它含有转录起始与RNA聚合酶特异性结合所需的保守序列，多数启动子位于基因转录起始点的上游，其本身不被转录。植物基因的启动子不仅是RNA聚合酶II识别的位点，还存在多种顺式作用元件。因此，植物基因的启动子对下游基因转录水平的调控主要发生在这些顺式元件与反式元件之间的相互作用。随着启动子基本功能顺式元件的确定及相关转录因子的鉴定，重要农作物基因组及表达谱信息的获得大大提高了启动子研究的便利性。随着分子生物学和遗传转化技术不断发展，具有不同特性的启动子相应成为研究热点。
[0003]启动子按其作用方式大体分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。组成型启动子不受外界因素影响，在多数植物组织中均可表达且在不同组织部位的表达水平没有明显差异，所以组成型启动子会造成植株生长发育过程中能量出现不必要的损耗和浪费。而特异性启动子是会驱动基因只在某些特定的部位或器官中表达，表现出发育调节的特性。从而克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加转基因的效果。其中，根是植物的营养器官，负责吸收土壤里面的水分、无机盐及可溶性小分子有机物质，并且具有支持、繁殖、贮存有机物质的作用。利用根特异性启动子，可以对重金属污染的土壤进行生物修复，也可对植物根系的整个发展状况进行遗传改良，或者为提高植物的抗旱性、抗病性等。而且生态环境恢复是现在研究的热点，相对于物理修复和化学修复，生物修复在土壤重金属污染中具有成本低、时效长、破化小等优点。故根特异性启动子的研究和开发具有重要的应用价值。
[0004]目前，有关杨树启动子的研究也一直在发展，人们选择或人工构建目的启动子，这不仅便于对新基因的功能研究，还可在杨树的特定部位或特定阶段实现对外源基因的精准调控。例如，将启动子的
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35区/
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10区序列突变为保守序列可以提高启动子的活性，将启动子的转录单元进行串联设计，也可以明显提高基因的转录水平，进而提高蛋白表达量。不过，现有研究主要涉及杨树维管组织特异性启动子等方面。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的问题，本专利技术的目的在于挖掘并利用杨树中的根系特异启动子，丰富了植物根特异启动子的选择性。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]本专利技术以南林895杨(P.deltoids
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P.euramericana，南京林业大学从美洲黑杨I
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69杨(P.deltoids)
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欧美杨I
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45杨(P.euramericana)杂交后代群体中选育出的优良无性系)为实验材料。取其生长状态良好、同一时期的野生型组培苗五个不同组织(根、茎段、叶片、顶芽、叶柄)的样品分别提取RNA后，进行高通量转录组测序，分析各基因在五个不同组织中的表达量数据，并计算出每个基因在根组织中表达量的平均值、在其他组织(茎段、叶片、顶芽、叶柄)中表达量平均值，以根组织中表达量的平均值除以其他组织中表达量平均值得到FC(Fold Change)值，再将FC值从大到小进行排列，取对应前100个基因进行差异显著性分析，计算出p值，p<0.05则在根中表达量与在其他组织中表达量的差异显著。
[0008]经过大量的筛选和验证，本专利技术得到了一个仅在根部表达且在其他4个组织中均不表达的基因Potri.009G008600，命名为CX03。对其启动子序列进行分析和验证，最终确定了序列如SEQ ID NO.1所示的根特异启动子。
[0009]基于上述根特异启动子，本专利技术提供了一种根特异基因表达盒，其包括权该根特异启动子、由该启动子启动转录的目的基因和终止子。在实际应用过程中，目的基因可根据实际需求进行选定，如目的基因可以富集或转运重金属，将其与该根特异启动子连接并转入植物根中特异表达时，可将土壤中的重金属进行吸附或者转运，从而达到修复土壤重金属污染的效果。
[0010]本专利技术还提供了包含上述根特异启动子的重组表达载体，以及包含该重组表达载体的重组菌。在某些实施例中，可用于接入该根特异启动子的表达载体为pKGWFS7，可用于包含该根特异启动子的细菌为农杆菌或大肠杆菌。
[0011]本专利技术还提供了上述根特异性启动子，或重组表达载体，或重组菌在植物中启动目的基因表达中的应用，具体可包括以下步骤：
[0012]S1、克隆权利要求1所述的根特异启动子，并构建包含所述根特异启动子和目的基因的重组表达载体；
[0013]S2、将所述重组表达载体转入农杆菌，再侵染植物的外植体，经历诱导愈伤、生芽、芽伸长和生根阶段，筛选得到植物转基因株系。
[0014]进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中克隆根特异启动子的方法为：以南林895杨的gDNA为模板，利用如SEQ ID NO:2～3所示的引物对进行扩增即得；另外，重组表达载体可通过BP反应和LR反应进行构建。
[0015]进一步地，在上述技术方案中，外植体为植物离体叶片。
[0016]进一步地，在上述技术方案中，目的基因表达是在植物根部表达。
[0017]本专利技术的有益效果为：本专利技术通过对杨树根系特异表达基因的筛选，挖掘到了一个根系特异启动子，并对其进一步的深入开发利用，对根系特异启动子在生产上的应用提供了技术支持。
附图说明
[0018]图1为部分候选基因在根中表达量平均值与其他组织中表达量平均值的比值；
[0019]图2为Actin内参基因(A)与基因CX03(B)在南林895杨五个不同组织中的表达量对比图；
[0020]图3为含CX03启动子的PKGWFS7表达载体转化大肠杆菌的菌液PCR检测结果图；
[0021]图4为转基因阳性苗的鉴定结果图，其中WT为野生型；
[0022]图5为转基因阳性苗的GUS染色图。
具体实施方式
[0023]下面将结合实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。
[0024]下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0025]实施例1
[0026]本实施例从南林895杨(NL895杨)中筛选并克隆出了一个杨树根系特异启动子。
[0027](1)杨根系特异表达基因的筛选及验证
[0028]首先，分别提取南林895杨五个不同组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于杨树的根特异启动子，其特征在于，所述根特异启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种根特异基因表达盒，其特征在于，包括权利要求1所述的根特异启动子、由该启动子启动转录的目的基因和终止子。3.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的根特异启动子或权利要求2所述的根特异基因表达盒。4.一种重组菌，其特征在于，包括权利要求3所述的重组表达载体。5.如权利要求1所述的根特异性启动子或权利要求2所述的重组载体或权利要求4所述的重组菌在植物中启动目的基因表达中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：S1、克隆权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪念，丁轶苇，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：