一种母体细胞自主的孤雌单倍体生殖方法及其育种应用技术

本发明专利技术公开了一种母体细胞自主的孤雌单倍体生殖方法及其育种应用。本发明专利技术提供了获得玉米孤雌单倍体的方法，包括：将介导玉米卵细胞异位表达ZmBBM2基因的CRISPRa5基因激活系统的系统载体导入受体玉米，得到阳性转基因玉米；由于植物卵细胞中ZmBBM2基因实现异位激活，导致卵细胞直接发育形成单倍体胚。本发明专利技术为获得作物单倍体提供了一种有效的途径。同时，为玉米孤雌生殖提供了新的基因资源，为其他作物的无融合生殖合成提供了新的思路。他作物的无融合生殖合成提供了新的思路。

【技术实现步骤摘要】
embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds.Nature,565,91
–
95.)。
[0004]在真核细胞中，基因表达在发育和分化等过程中受到严格的控制。转录因子通过与靶基因增强子和启动子区域的特定DNA序列结合，是调控靶基因转录的关键调控因子(Spitz,F.and Furlong,E.E.M.(2012)Transcription factors:from enhancer binding to developmental control.Nat.Rev.Genet.,13,613
–
626.)。基于同样的原理，人工转录因子(Artificial Transcription Factors，ATFs)是将具有序列特异性的DNA结合域融合到激活结构域以调节基因表达，如锌指ATF(Wilson,K.A.,Chateau,M.L.,and Porteus,M.H.(2013)Design and development of artificial z本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种获得玉米孤雌单倍体的方法，包括如下步骤：将用于介导玉米卵细胞异位表达ZmBBM2基因的CRISPRa5基因激活系统的系统载体导入受体玉米，得到阳性转基因玉米；所述转基因阳性玉米的部分胚囊中的卵细胞能直接发育成为单倍体胚,形成单倍体种子；所述系统载体能够表达dCas9
‑
VP64融合蛋白，能够表达MS2
‑
P65
‑
HSF1融合蛋白，并且能够表达靶向ZmBBM2基因转录起始点上游
‑
200至
‑
1bp位置的一个或若干个sgRNA，所述sgRNA为sgRNA2.0。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述系统载体上含有如下2个表达盒：表达盒1：用于表达2个所述sgRNA；在所述表达盒1中，含有2个sgRNA的编码序列，2个所述sgRNA的编码序列以拟南芥At
‑
tRNAGly编码序列连接，由同一个启动子启动转录；表达盒2：用于表达功能蛋白，所述功能蛋白为将所述dCas9
‑
VP64融合蛋白和所述MS2
‑
P65
‑
HSF1融合蛋白通过自裂解多肽T2A融合而成；在所述表达盒2中，所述功能蛋白由植物卵细胞特异性启动子启动转录。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在所述表达盒1中，所述启动子为ZmU6
‑
2启动子；和/或在所述表达盒2中，所述植物卵细胞特异性启动子为拟南芥DD45启动子；和/或所述dCas9
‑
VP64融合蛋白和所述MS2
‑
P65
‑
HSF1融合蛋白均含有核定位信号。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述表达盒1自5
’
端到3
’
端依次由所述ZmU6
‑
2启动子、靶向ZmBBM2基因转录起始点上游
‑
36bp区域的sgRNA间隔序列的编码核酸、sgRNA2.0支架编码序列、所述拟南芥At
‑
tRNAGly编码序列、靶向ZmBBM2基因转录起始点上游
‑
166bp区域的sgRNA间隔序列的编码核酸、所述sgRNA2.0支架编码序列组成；和/或所述表达盒2自5
’
端到3
’
端依次由所述拟南芥DD45启动子、3
×
Flag标签编码核酸、SV40核定位信号编码序列、dCas9编码基因、NLS核定位信号编码序列、VP64编码基因、所述自裂解多肽T2A的编码基因、MS2编码基因、所述SV40核定位信号编码序列、P65编码基因、HSF1编码基因和转录终止子NOS组成。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述ZmU6
‑
2启动子如SEQ ID No.16的第1
‑
397位所示；和/或所述靶向ZmBBM2基因转录起始点上游
‑
36bp区域的sgRNA间隔序列的编码核酸如SEQ ID No.16的第398
‑
417位所示；和/或所述sgRNA2.0支架编码序列如SEQ ID No.16的第418
‑
553位或第651
‑
793位所示；和/或所述拟南芥At
‑
tRNAGly编码序列如SEQ ID No.16的第554
‑
630位所示；和/或所述靶向ZmBBM2基因转录起始点上游
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢传晓，祁显涛，高惠敏，刘昌林，朱金洁，黄晶，徐孝洁，赵延明，毛文博，吕仁瑶，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：