一种构建全基因组甲基化测序文库的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建全基因组甲基化测序文库的方法，涉及基因组学、表观遗传学和分子生物学技术领域。本发明专利技术通过省去除盐氧化步骤中的乙醇沉淀步骤，极大程度上节省了操作时间，而且去除乙醇沉淀步骤几乎不影响氧化和转化效率，且不影响建库后文库质量以及测序数据质量；同时在重亚硫酸盐处理后经单链DNA到双链DNA的转化过程后可以使用通用的双链建库试剂盒进行文库构建。因此，本发明专利技术提供的方法具有操作流程便捷、省时，且构建方法全面实现国产化，降低了国外试剂盒的依赖性。本发明专利技术提供的方法对于基因组DNA具有更高的利用率。同时，经验证，使用本发明专利技术提供的方法极大程度上提高了文库构建的效率，降低了文库初始上样量和建库成本。库成本。库成本。

【技术实现步骤摘要】
一种构建全基因组甲基化测序文库的方法


[0001]本专利技术涉及基因组学、表观遗传学和分子生物学
，具体而言，涉及一种构建全基因组甲基化测序文库的方法。

技术介绍

[0002]表观遗传学作为近年来炙手可热的研究方向，其研究深入到各个学科领域，在疾病筛查、诊断和治疗等方面获得了显著突破。其中，DNA甲基化通过调控基因的转录和表达，在细胞分化和疾病发生中发挥重要作用，成为当前表观遗传学的热门研究领域。传统DNA甲基化检测方法是基于限制性内切酶CpG位点的识别作用。本世纪初，基于重亚硫酸氢盐处理检测甲基化修饰的方法开始问世，随后甲基化高通量测序技术被不断改进和创新。虽然脱氨酶的使用能够改善化学处理方法对模板的强损害作用，但基于BS转化的WGBS方法仍是甲基化检测的“金标准”。
[0003]传统的WGBS法流程主要包括1)DNA样本片段化，2)末端修复加“A”，3)甲基化接头连接，4)纯化，5)BS处理，6)PCR文库富集。该方法的关键是接头序列必须经过甲基化处理，从而防止接头被BS转化，而这样既增加成本，又不利于建库流程的通用化；此外，因BS转化过程中会产生少量过度甲基化，即甲基化的C转变为U，若过度甲基化发生在接头上，也会影响测序；再者，因BS转化会使大量文库片段断裂，不仅直接导致文库的丰富度降低、PCR循环数增加，进而影响测序复杂度，同时也会增加对建库起始投入量的需求。
[0004]针对传统WGBS法所需数据量庞大，花费较高的问题，简化基因组甲基化测序RRBS提供了一种经济有效的解决方案。但是，虽然RRBS对约85％的CpG岛有用，大大降低了测序成本，它的设计仅限于<3％的基因组上包含MspI酶切割的位点，具有一定的局限性；其次被MspI酶切的位点缺少碱基多样性，测序起始时会干扰仪器校准和簇检测。近年来，随着杂交捕获技术的发展，甲基化定制探针成了一个热门方向。杂交捕获法虽能通过针对目标序列设计探针，做到精确检测甲基化位点和区域，但这种方法需建立在对甲基化情况信息有一定的了解，以及对疾病发生的基因信息有准确的定位之上；另外在杂交捕获的过程中，非特异性杂交也是一个需要解决的问题。
[0005]PBAT法是先经过BS转化再进行文库构建的方法，该方法能够有效避免传统WGBS方法的局限性。根据建库时DNA链的状态可以将甲基化建库方法分为单链建库和双链建库两种。基于PBAT的单链建库法主要分为单链末端加接头法和随机引物加接头与单链退火法，前者能最大化连接BS转化后的单链DNA，防止BS转化后单链DNA的损失，但该法对实验操作和试剂的需求相对较高；后者随机引物与模板DNA的结合效率会在一定程度上受到所连接接头的影响，并具有一定的延伸偏好性。而基于PBAT的双链建库法通过扩增酶和随机引物将BS后的ssDNA转化为dsDNA，随后使用通用型双链建库试剂盒即可完成BS文库构建，此过程无需额外的甲基化的接头，既高效，又快速实用。
[0006]目前国际上经典的PBAT法WGBS试剂盒有两款：美国Epigentek集团公司的EpiNext
TM
Post
‑
Bisulfite DNA Library Preparation Kit(Illumina)(货号：P
‑
1055)和德
国Qiagen的QIAseq Methyl Library Kit/EpiTect Bisulfite Kit(货号：59104)，但这两款进口试剂盒操作流程复杂，费用昂贵，测试结果并不理想，对大样本量实验操作并不友好；而国内相同方法做甲基化测序的几家生物公司(如：易基因、华大基因和翌圣生物)虽使用成本稍低的ZYMO的BS处理试剂盒，却并没有做到完全国产化。
[0007]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种构建全基因组甲基化测序文库的方法以解决上述技术问题。
[0009]本专利技术是这样实现的：
[0010]本专利技术提供一种构建全基因组甲基化测序文库的方法，该方法包括如下步骤：
[0011]将片段化的DNA用Tiangen BS转化试剂盒进行重亚硫酸盐处理或片段化的DNA经除盐氧化后用Tiangen BS转化试剂盒(DNA重亚硫酸盐转化试剂盒，DP215
‑
02，天根)进行重亚硫酸盐处理；除盐氧化步骤包括：直接将片段化的DNA通过离子交换柱以去除盐离子用于氧化；
[0012]将重亚硫酸盐处理后的单链DNA转化为双链DNA；单链DNA转化为双链DNA包括：将重亚硫酸盐处理后的单链DNA与转化反应液混合，变性，冷却后加入转化酶，进行转化反应；转化酶选自phi29和Klenow Fragment中的一种或两种；
[0013]将转化后的双链DNA进行末端修复和3
’
末端添加碱基A；
[0014]将末端修复且3
’
末端添加碱基A后的DNA片段与接头连接，以获得具有接头的连接产物；
[0015]将连接产物进行纯化，选择出目标大小片段；
[0016]将目标大小片段进行文库扩增，获得的文库为全基因组甲基化测序文库。
[0017]现有技术中，作为基因组DNA甲基化修饰检测的“金标准”—WGBS并不能将甲基化与羟甲基化修饰区分，因此衍生出基于BS的OxBS方法，该方法将羟甲基化修饰的胞嘧啶(5hmC)氧化为可被BS转化的5fC，而后在文库扩增时转变为T，因此，测序结果中的C仅为甲基化修饰的C。而OxBS方法中因氧化剂对基因组中的盐离子等杂质非常敏感，为得到较为纯净的DNA，需增加耗时耗力的乙醇沉淀和过柱纯化流程。
[0018]专利技术人通过省去除盐氧化步骤中的乙醇沉淀步骤，极大程度上节省了操作时间(节约近3小时)，而且去除乙醇沉淀步骤几乎不影响氧化和转化效率，且不影响建库后文库质量以及测序数据质量。此外，专利技术人将德国的Qiagen的BS试剂盒改为国内的BS试剂盒(Tiangen BS转化试剂盒)和通用的双链建库试剂盒，可以节省
‑
9.5个小时反应时间，且不影响转化效率。因此，本专利技术提供的方法具有操作流程便捷、省时，且构建方法全面实现国产化，降低了国外试剂盒的依赖性。本专利技术提供的方法全部使用国产试剂盒，采用常规的酶实现单链到双链的转化，经统计，在缩短建库时长的同时，使建库所需人工及试剂成本降低至进口试剂盒的1/3以下。
[0019]本专利技术提供的方法对于基因组DNA具有更高的利用率。具体地，重亚硫酸盐技术虽然能够有效地将未甲基化修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶，但由此化学过程严重破坏了DNA链的完整性，致使90％以上的DNA碎片化，无法构建有效文库。而本专利技术将BS产物变性后利用
phi29或Klenow Fragment在随机引物的引导下由单链合成为双链，保证了模板的最大利用率和文库的丰富度。
[0020]同时，经验证，使用本专利技术提供的方法的文库产率是同等条件下美国Epigentek集团公司的EpiNe本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建全基因组甲基化测序文库的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将片段化的DNA直接用Tiangen BS转化试剂盒进行重亚硫酸盐处理或片段化的DNA经除盐氧化后用Tiangen BS转化试剂盒进行重亚硫酸盐处理；所述除盐氧化步骤包括：直接将片段化的DNA通过离子交换柱以去除盐离子用于氧化；将所述重亚硫酸盐处理后的单链DNA转化为双链DNA；所述单链DNA转化为双链DNA包括：将重亚硫酸盐处理后的单链DNA与转化反应液混合，变性，冷却后加入转化酶，进行转化反应；所述转化酶选自phi29和Klenow Fragment中的一种或两种；将所述转化后的双链DNA进行末端修复和3
’
末端添加碱基A；将末端修复且3
’
末端添加碱基A后的DNA片段与接头连接，以获得具有接头的连接产物；将所述连接产物进行纯化，选择出目标大小片段；将所述目标大小片段进行文库扩增，获得的文库为全基因组甲基化测序文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化酶选自Klenow Fragment；优选地，所述转化反应液包括转化缓冲液、转化引物和dNTPs；优选地，所述转化反应包括在37℃
±
0.5℃反应50
‑
60min；优选地，所述转化引物为5
’‑
P
‑
d(NNNN*N*N)
‑
3'，N＝A,C,G或T，*为硫代修饰。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述片段化的DNA来源于哺乳动物、植物或微生物；优选地，所述哺乳动物选自小鼠或人；优选地，所述片段化是将基因组DNA在超声打断仪上片段化；优选地，所述基因组DNA的量为10ng
‑
1000ng；优选地，所述基因组DNA的量为100ng
‑
500ng；优选地，所述片段化的时间为15
‑
38min；优选地，所述片段化的时间为25min，所述片段化后的DNA片段范围为200
‑
1000bp。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述末端修复和3
’
末端添加碱基A是将转化后的双链DNA在End Repair Buffer和End Repair Enzyme作用下，在30℃
±
0.5℃反应20
‑
25min，然后在7...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈清，李志文，薛添香，张杰，赖伟，
申请(专利权)人：生工生物工程上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：