启动子突变体文库的构建方法及启动子突变体文库技术

本公开属于生物技术和基因工程技术领域，具体涉及谷氨酸棒杆菌启动子突变体文库的构建方法、具有启动子活性的多核苷酸，包含具有启动子活性的多核苷酸的启动子突变体文库、转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及调控目标基因转录的方法、制备蛋白的方法和生产目标化合物的方法。本公开首先提供了谷氨酸棒杆菌启动子突变体文库的构建方法，通过该方法可以获得一系列高活性的启动子突变体，通用性广，为目标基因的改造提供了具有高启动子活性的丰富的启动子元件。的丰富的启动子元件。的丰富的启动子元件。

【技术实现步骤摘要】
启动子突变体文库的构建方法及启动子突变体文库


[0001]本公开属于生物技术和基因工程
，具体涉及启动子突变体文库的构建方法、具有启动子活性的多核苷酸，包含具有启动子活性的多核苷酸的启动子的突变体文库、转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及调控目标基因转录的方法、制备蛋白的方法和生产目标化合物的方法。

技术介绍

[0002]微生物发酵法可以生产多种目标化合物，如氨基酸、有机酸等，这些目标化合物可广泛应用于医药、食品、动物饲料和化妆品等领域，具有巨大的经济价值。近年来，随着对氨基酸、有机酸等市场需求的不断增加，如何提高目标化合物的产量，实现对目标化合物的工业化大规模生产，是当前亟需解决的重要问题。
[0003]选育高产的发酵微生物是提高目标化合物工业化产量的重要手段，与传统诱变育种的技术相比，基因工程选育技术由于其强的针对性和高效性获得了广泛性的应用。众多研究表明，目标化合物的合成途径关键基因的高效表达是提高目标化合物产量和转化率的关键。
[0004]通过基因工程的方法对微生物代谢途径中的关键基因进行改造，是提高目标化合物的发酵产量的重要方法。启动子是影响基因表达的重要调控元件，启动子的精细调控可以实现目标化合物转化率的最优化。具有不同表达强度的启动子，可以满足不同基因不同表达强度的需求，进而可以提高目标化合物的产量和转化率。因此，开发更多具有高活性的启动子，以增强目标化合物合成途径关键基因的表达，提高目标化合物的产量，提升生物发酵产业的竞争力，是微生物发酵领域亟需解决的重要问题。
[0005]然而，目前高活性启动子突变体的构建方法多为针对某一个启动子而进行的特定改造，方法没有通用性，获得的启动子数量也十分有限，强度范围也十分有限。因此，开发具有普适性的启动子突变体构建方法，构建具有表达强度范围更广泛的启动子文库，是获得高效启动子突变体是亟需解决的重要问题。

技术实现思路

[0006]专利技术要解决的问题
[0007]鉴于现有技术中存在的技术问题，例如，需要开发更多具有高活性的启动子，以提高目标化合物合成途径中关键基因的表达。为此，本公开首先提供了一种谷氨酸棒杆菌启动子突变体文库的构建方法，通过该方法可以获得一系列高活性的启动子突变体，通用性广，为目标基因的改造提供了丰富的启动子元件。
[0008]在一些实施方式中，本公开提供了一系列具有启动子活性的多核苷酸，为包含如 SEQ ID NO：1
‑
11任一项所示序列的野生型启动子的突变体，与野生型启动子相比，本公开提供的启动子突变体的启动子活性显著提高，为目标基因的改造提供了极具应用潜力的表达调控元件。将启动子突变体与目标基因可操作性地连接，可有效提高目标基因的表达，进
而可有效提高目标化合物的产量、转化率。
[0009]用于解决问题的方案
[0010]本公开首先分析得到了谷氨酸棒杆菌野生型启动子的
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10区，并创造性地发现
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10区的第一个碱基为T、第二个碱基为A、第六个碱基为T以及
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10上游的第二个碱基为G对启动子活性非常重要，在此基础上提出了启动子库的构建方法。
[0011]本公开提供了一种谷氨酸棒杆菌启动子突变体文库的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
[0012]构建包含至少一个野生型启动子的启动子文库；
[0013]将所述野生型启动子的
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10区序列突变为TANNNT，将直接连接于所述
‑
10区上游的随机区序列突变为NNNNNNNNNNNNNNGN、NNNNNNNNNNNNNNNGN或 NNNNNNNNNNNNNNNNGN中的任一种，以获得启动子突变体；其中，N代表A、T、C、 G中的任一种；并且，所述突变序列不包含如SEQ ID NO：289
‑
299任一项所示的核苷酸序列；
[0014]优选地，所述启动子突变体与所述野生型启动子相比，具有提高的启动子活性。
[0015]在一些实施方式中，根据本公开所述的构建方法，其中，所述野生型启动子为与氨基酸合成相关的酶的编码基因的启动子；优选地，所述野生型启动子为与赖氨酸合成相关的酶的编码基因的启动子；
[0016]优选地，所述野生型启动子为选自如下一种或多种酶的编码基因的启动子：
[0017]转酮醇酶(tkt)、转醛醇酶(tal)、核糖
‑5‑
磷酸异构酶(rpi)、葡萄糖
‑6‑
磷酸异构酶(pgi)、果糖二磷酸醛缩酶(fda)、磷酸甘油酸变位酶(gpmA)、烯醇化酶(eno)、柠檬酸合酶(gltA)、乌头酸水合酶(acn)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、二氢吡啶二羧酸合成酶(dapA)。
[0018]本公开提供了一种具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述具有启动子活性的多核苷酸为野生型启动子的启动子突变体，所述启动子突变体包括10区突变序列和直接连接于所述
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10区突变序列上游的随机区突变序列；所述
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10区突变序列为TANNNT，所述随机区突变序列选自：NNNNNNNNNNNNNNGN、NNNNNNNNNNNNNNNGN或 NNNNNNNNNNNNNNNNGN；其中，N代表A、T、C、G中的任一种；所述突变序列不包含如SEQ ID NO：289
‑
299任一项所示的核苷酸序列；
[0019]并且，所述启动子突变体与所述野生型启动子相比，具有提高的启动子活性。
[0020]在一些实施方式中，根据本公开所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述野生型启动子为与氨基酸合成相关的酶的编码基因的启动子；优选地，所述野生型启动子为与赖氨酸合成相关的酶的编码基因的启动子；
[0021]优选地，所述野生型启动子为选自如下一种或多种酶的编码基因的启动子：
[0022]转酮醇酶(tkt)、转醛醇酶(tal)、核糖
‑5‑
磷酸异构酶(rpi)、葡萄糖
‑6‑
磷酸异构酶(pgi)、果糖二磷酸醛缩酶(fda)、磷酸甘油酸变位酶(gpmA)、烯醇化酶(eno)、柠檬酸合酶(gltA)、乌头酸水合酶(acn)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、二氢吡啶二羧酸合成酶(dapA)。
[0023]在一些实施方式中，根据本公开所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述启动子突变体的核心区选自如下(i)
‑
(iv)组成的组中的任一项：
[0024](i)包含如SEQ ID NO：203
‑
213任一项所示的核苷酸序列；
[0025](ii)包含与(i)所示的核苷酸序列的反向互补序列；
[0026](iii)包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所
示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
[0027](iv)与(i)或(ii)所示的核苷酸序列具有至少90本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸棒杆菌启动子突变体文库的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：构建包含至少一个野生型启动子的启动子文库；将所述野生型启动子的
‑
10区序列突变为TANNNT，将直接连接于所述
‑
10区序列上游的随机区序列突变为NNNNNNNNNNNNNNGN、NNNNNNNNNNNNNNNGN或NNNNNNNNNNNNNNNNGN中的任一种，以得到启动子突变体；其中，N代表A、T、C、G中的任一种；并且，所述突变序列不包含如SEQ ID NO：289
‑
299任一项所示的核苷酸序列；优选地，所述启动子突变体与所述野生型启动子相比，具有提高的启动子活性。2.根据权利要求1所述的构建方法，其中，所述野生型启动子为与氨基酸合成相关的酶的编码基因的启动子；优选地，所述野生型启动子为与赖氨酸合成相关的酶的编码基因的启动子；优选地，所述野生型启动子为选自如下一种或多种酶的编码基因的启动子：转酮醇酶(tkt)、转醛醇酶(tal)、核糖
‑5‑
磷酸异构酶(rpi)、葡萄糖
‑6‑
磷酸异构酶(pgi)、果糖二磷酸醛缩酶(fda)、磷酸甘油酸变位酶(gpmA)、烯醇化酶(eno)、柠檬酸合酶(gltA)、乌头酸水合酶(acn)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、二氢吡啶二羧酸合成酶(dapA)。3.一种具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述具有启动子活性的多核苷酸为野生型启动子的启动子突变体；所述启动子突变体包括
‑
10区突变序列和直接连接于所述
‑
10区突变序列上游的随机区突变序列；所述
‑
10区突变序列为TANNNT，所述随机区突变序列选自：NNNNNNNNNNNNNNGN、NNNNNNNNNNNNNNNGN或NNNNNNNNNNNNNNNNGN；其中，N代表A、T、C、G中的任一种；所述突变序列不包含如SEQ ID NO：289
‑
299任一项所示的核苷酸序列；并且，所述启动子突变体与所述野生型启动子相比，具有提高的启动子活性。4.根据权利要求3所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述野生型启动子为与氨基酸合成相关的酶的编码基因的启动子；优选地，所述野生型启动子为与赖氨酸合成相关的酶的编码基因的启动子；优选地，所述野生型启动子为选自如下一种或多种酶的编码基因的启动子：转酮醇酶(tkt)、转醛醇酶(tal)、核糖
‑5‑
磷酸异构酶(rpi)、葡萄糖
‑6‑
磷酸异构酶(pgi)、果糖二磷酸醛缩酶(fda)、磷酸甘油酸变位酶(gpmA)、烯醇化酶(eno)、柠檬酸合酶(gltA)、乌头酸水合酶(acn)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、二氢吡啶二羧酸合成酶(dapA)。5.根据权利要求3或4所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述启动子突变体的核心区选自如下(i)
‑
(iv)组成的组中的任一项：(i)包含如SEQ ID NO：203
‑
213任一项所示的核苷酸序列；(ii)包含与(i)所示的核苷酸序列的反向互补序列；(iii)包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；(iv)与(i)或(ii)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的核苷酸序列；并且，所述启动子突变体的核心区不包含如SEQ ID NO：192
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202任一项所示的核苷酸序列；优选地，所述启动子突变体选自如下(v)
‑
(viii)组成的组中的任一项：(v)包含如SEQ ID NO：214
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224任一项所示的核苷酸序列；
(vi)包含与(v)所示的核苷酸序列的反向互补序列；(vii)包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；(viii)与(v)或(vi)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的核苷酸序列；并且，所述启动子突变体不包含如SEQ ID NO：1
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11任一项所示的核苷酸序列。6.根据权利要求3
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5任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述突变序列选自如下的任一项：
7.根据权利要求3
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6任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，启动子突变体选自如下(a)
‑
(d)组成的组中的任一项：(a)包含如SEQ ID NO：12
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187任一项所示的核苷酸序列；(b)包含与(b)所示的核苷酸序列的反向互补序列；(c)包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(a)或(b)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；(d)与(a)或(b)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的核苷酸序列。8.一种启动子的突变体文库，其中，所述启动子的突变体文库包含根据权利要求3
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7任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸。9.一种转录表达盒，其中，所述转录表达盒包含根据权利要求3
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7任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸；可选地，所述转录表达盒还含有目标基因，所述目标基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接；优选地，所述目标基因为蛋白编码基因。10.一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含权利要求3
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7任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑平，刘娇，孙际宾，周文娟，孙冠男，赵晓佳，刘欣洋，王钰，倪晓蒙，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：