基于ES-DMA-CPC颗粒计数的蛋白质定量方法技术

本发明专利技术公开了一种基于ES

【技术实现步骤摘要】
基于ES
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DMA
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CPC颗粒计数的蛋白质定量方法


[0001]本专利技术涉及生物化学检测
，特别是涉及一种基于ES
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DMA
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CPC颗粒计数的蛋白质定量方法。

技术介绍

[0002]蛋白质是一种非常重要的生物大分子,其存在和表达与生物体的生理或病理变化密切相关。在过去几十年里，随着蛋白质含量测定在临床领域发挥的重要作用，特别是在疾病诊断、监测和药物开发等方面，对于蛋白质准确定量的需求日益增加。与DNA结构不同的是，不同生物环境下的蛋白都有不同的结构和功能，且生物样本具有巨大的复杂性，因此有必要开发基于不同原理的蛋白定量方法。
[0003]颗粒计数是环境监测中的一项重要技术。近年来，随着化学和生物分析领域的不断发展，该技术逐渐应用于其他行业，在蛋白定量方面目前常用的是单粒子电感耦合等离子体质谱法和数字酶联免疫吸附法。然而目前这两种方法无法对蛋白直接计数，都是将蛋白标记后，通过定量标记物的浓度间接得到目标蛋白的浓度，该过程中的标记效率以及蛋白活性等因素都会影响最终结果的测定。
[0004]申请人于CN110873683B公开了一种基于ES
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DMA
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CPC的高准确度蛋白质标准物质定值方法，包括如下步骤：1)准备待测目标蛋白；2)待测蛋白样品用乙酸铵缓冲液稀释；3)配制蔗糖溶液，样品通过进样泵注入电喷雾气溶胶发生器中，通过25μm内径的毛细管产生雾化的高电荷液滴，液滴蒸发干燥后，带电粒子通过差分电迁移率纳米柱；使用蔗糖溶液进行液滴尺寸计算；4)将蛋白样品分别通过进样泵注入电喷雾气溶胶颗粒发生器中，通过25μm内径的毛细管产生雾化的高电荷液滴，液滴蒸发干燥后，带电粒子通过差分电迁移率分析，由粒子计数器获得蛋白样品的粒径分布；5)线性回归拟合获得单体Cp1和二聚体Cp2的绝对数浓度，然后确定三聚体浓度Cp3；求和来确定待测目标蛋白质样品的原始浓度。
[0005]该定量方法虽然能够通过单体Cp1、二聚体Cp2和三聚体Cp3的浓度计算得到目标蛋白质样品的原始浓度，但是该方法需要蛋白粒子通过诱导聚集形成二聚体，随着蛋白分子量的增大，粒径分布大的蛋白质形成二聚体会愈发困难，对于无法形成二聚体的蛋白，该方法的应用就受到了限制。
[0006]综上所述，目前在蛋白质定量检测
，亟需开发一种不受免疫反应中蛋白活性和标记效率等因素影响的、可适用于大分子量、且基于单粒子计数的蛋白质定量方法。

技术实现思路

[0007]针对上述现有技术中的不足之处，本专利技术提供了一种基于ES
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DMA
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CPC颗粒计数的蛋白质定量方法。该方法采用电喷雾
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差分电迁移率
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粒子计数技术测量溶液中的蛋白含量，通过标准物质的测量得到对应的校准因子，进而可以实现同种未知蛋白样品含量的测定。此外，对于没有标准物质的蛋白质样品，可以通过测定三种及以上具有不同粒径分布的蛋白标准物质的校准因子，将仪器检测到的蛋白标准物质粒径分布和相应的校准因子进行
线性回归拟合，根据回归方程得到不同粒径分布的蛋白质及其对应的校准因子，实现对不同种蛋白质样品含量的测定。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案具体如下：
[0009]电喷雾
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差分电迁移率
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粒子计数技术(ES
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DMA
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CPC)主要由三部分仪器完成，包括电喷雾气溶胶发生器(ES)、差分电迁移率分析仪(DMA)和凝聚核颗粒计数器(CPC)，此外，电喷雾气溶胶发生器与差分电迁移率分析仪之间通常加入一个电荷中和器来平衡粒子的电荷分布，使得90％以上的液滴仅带上一个单电荷，从而使粒子在DMA中发生迁移时，仅与粒子的大小有关。
[0010]本专利技术ES
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DMA
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CPC颗粒计数的工作原理为：将配置的蛋白样品分别通过进样泵注入电喷雾气溶胶颗粒发生器中，通过25μm内径的毛细管产生雾化的高电荷液滴，液滴蒸发干燥后，带电粒子通过差分电迁移率分析，由粒子计数器获得蛋白样品的粒径分布和检测到的粒子数，根据蛋白样品的粒径分布和粒子数蛋白，以及获得的校准因子，从而实现对蛋白的定量分析。
[0011]本专利技术提供的基于ES
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DMA
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CPC颗粒计数的蛋白质定量方法，包括以下步骤：
[0012](1)校准因子的测定
[0013]采用乙酸铵缓冲溶液将所述蛋白标准物质稀释，将配置的蛋白样品通过进样泵注入电喷雾气溶胶颗粒发生器中，通过25μm内径的毛细管产生雾化的高电荷液滴，液滴蒸发干燥后，带电粒子通过差分电迁移率分析，由粒子计数器获得蛋白样品的粒径分布；通过积分得到检测的粒子总数，根据蛋白标准物质的浓度标准值，将粒子总数与标准值对应的粒子数之比获得所述蛋白标准物质的校准因子，具体可见公式(1)：
[0014][0015]其中，K为校准因子，C
CPC
为粒子计数器通过积分后获得的粒子总数，为所述蛋白标准物质的浓度标准值对应的粒子数；
[0016]蛋白标准物质的浓度标准值对应的粒子数浓度计算具体可见公式(2)
[0017][0018]其中，为蛋白标准物质的浓度标准值，MW为分子量，N
A
为阿伏伽德罗常数；
[0019](2)已知校准因子的蛋白样品的定量
[0020]按照步骤(1)由蛋白标准物质得到该类蛋白质的校准因子，对该类已知校准因子的蛋白样品进行定量时，将蛋白样品通过ES
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DMA
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CPC进行分析，获得检测到的粒子总数C
CPC
，根据校准因子，计算得到待测蛋白质样品的浓度，具体可见公式(3)：
[0021][0022]其中，C
m
为待测蛋白样品的质量浓度，C
CPC
为粒子计数器通过积分后获得的粒子总数，K为校准因子，m为稀释倍数，MW为待测样品的分子量，N
A
为阿伏伽德罗常数。
[0023](3)未知校准因子的蛋白质样品的定量对未知校准因子的蛋白质样品进行定量时，选择三种及以上具有不同粒径分布的蛋白标准物质，根据步骤(1)测定蛋白标准物质的校准因子和粒径分布，将仪器检测到的蛋白标准物质粒径分布和相应的校准因子进行线性
回归拟合，得到不同粒径分布的蛋白质及其校准因子的回归方程；将未知校准因子的待测蛋白质样品通过ES
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DMA
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CPC进行分析，获得蛋白样品的粒径分布和检测到的粒子总数；根据粒径和回归方程拟合获得校准因子，由公式(3)计算得到待测蛋白质样品的浓度。
[0024]其中，所述步骤(1)中，乙酸铵缓冲溶液的配制方法为，取适量乙酸铵配制成20mmol/L缓冲液，过滤并用氨水调节溶液pH为8。蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于ES
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DMA
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CPC颗粒计数的蛋白质定量方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)校准因子的测定采用乙酸铵缓冲溶液将蛋白标准物质稀释，将配置的蛋白样品通过进样泵注入电喷雾气溶胶颗粒发生器中，通过25μm内径的毛细管产生雾化的高电荷液滴，液滴蒸发干燥后，带电粒子通过差分电迁移率分析，由粒子计数器获得蛋白样品的粒径分布；通过积分得到检测的粒子总数，根据蛋白标准物质的浓度标准值，将粒子总数与标准值对应的粒子数之比获得所述蛋白标准物质的校准因子，具体可见公式(1)：其中，K为校准因子，C
CPC
为粒子计数器通过积分后获得的粒子总数，为所述蛋白标准物质的浓度标准值对应的粒子数；蛋白标准物质的浓度标准值对应的粒子数浓度计算具体可见公式(2)：其中，为蛋白标准物质的浓度标准值，MW为分子量，N
A
为阿伏伽德罗常数；(2)已知校准因子的蛋白样品的定量按照步骤(1)由蛋白标准物质得到该类蛋白质的校准因子，对该类已知校准因子的蛋白样品进行定量时，将蛋白样品通过ES
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DMA
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CPC进行分析，获得检测到的粒子总数C
CPC
，根据校准因子，计算得到待测蛋白质样品的浓度，具体可见公式(3)：其中，C
m
为待测蛋白样品的质量浓度，C
CPC
为粒子计数器通过积分后获得的粒子总数，K为校准因子，m为稀释倍数，MW为待测样品的分子量，N
A
为阿伏伽德罗常数。2.根据权利要求1所述的基于ES
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DMA
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CPC颗粒计数的蛋白质定量方...

【专利技术属性】
技术研发人员：米薇，戴新华，胡志上，张馨艺，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：