一种基于Fmoc基团诱导的自组装抗菌肽W7ff及其制备方法与其自组装结构的应用技术

本发明专利技术公开一种基于Fmoc基团诱导的自组装抗菌肽W7ff及其制备方法与其自组装结构的应用，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，分子式如式(I)所示：将W7ff在PB缓冲液中，于80℃下孵育1h后，获得自组装纳米结构。自组装后的W7ff对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌杀菌活性较好；组装前后W7ff在组装前后的溶血率均随着肽浓度的增加而升高，浓度小于64μM时溶血率低于10％，在最小抑菌浓度范围内无溶血现象出现，均有良好的生物相容性。综上所述，本发明专利技术的抗菌肽W7ff具有自组装能力，是一条拥有较好抑菌活性和生物相容性的抗菌肽。性的抗菌肽。性的抗菌肽。

【技术实现步骤摘要】
一种基于Fmoc基团诱导的自组装抗菌肽W7ff及其制备方法与其自组装结构的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于Fmoc基团诱导的自组装抗菌肽W7ff及其制备方法与其自组装结构的应用。

技术介绍

[0002]传统抗生素的滥用导致耐药菌株的出现，细菌对抗生素产生耐药性的问题正对全球公共卫生安全造成越来越严重的威胁。因此，开发新型抗生素或抗生素替代品成为了解决细菌产生耐药性问题的首要选择。抗菌肽具有无毒副作用(仅小部分对细胞具有溶血性)、不易产生耐药性、使用无残留、对环境无污染等优点，这些优点使得抗菌肽成为一种非常有前途的抗生素替代物。但抗菌肽在畜牧业的实际应用中，存在着半衰期短、活性低、稳定性差、合成费用高的局限性，为解决这些问题，常用的抗菌肽类似物的设计策略有D型氨基酸的引用、环化及纳米结构的构建。
[0003]多肽与某些疏水性较高的基团连接获得自组装能力，通过分子间作用力形成稳定的纳米结构。自组装纳米肽的生物学活性较高，有很好的生物相容性和稳定性，在药物载体、抗菌等领域具有良好的应用前景。

技术实现思路

[0004]鉴于以上背景，本专利技术的目的是提供一种基于Fmoc基团诱导的自组装抗菌肽W7ff，Fmoc基团与七肽重复序列连接，与序列中具有芳香性侧链的色氨酸共同诱导抗菌肽进行自组装形成纳米结构，赋予抗菌肽较好的抑菌活性。
[0005]本专利技术所采用的技术方案如下：一种基于Fmoc基团诱导的自组装抗菌肽W7ff，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，分子式如式(I)所示：
[0006][0007][0008]所述的Fmoc基团为9
‑
芴甲氧羰基，序列中苯丙氨酸为D型苯丙氨酸。
[0009]本专利技术的另一目的是提供一种具有自组装能力的抗菌肽W7ff的制备方法，步骤如下：
[0010](1)Fmoc基团连接七肽重复序列，该重复序列“abcdefg”，可形成α
‑
螺旋线圈，其中“a”和“d”位置上的疏水残基选择色氨酸，而其它位置的氨基酸则选择带有正电荷的精氨酸，为多肽提供足够正电荷；引用D型苯丙氨酸进一步提高抗菌肽的稳定性，在保证正电荷和疏水性足够的前提下，Fmoc基团与具有芳香性侧链的色氨酸能够共同诱导该序列自组装形成纳米结构；
[0011](2)采用固相化学合成法，使用多肽合成仪合成肽树脂，然后经过三氟乙酸切割；
[0012](3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成多肽的制备，命名为抗菌肽W7ff。
[0013]本专利技术的另一目的是提供一种基于Fmoc基团诱导的自组装抗菌肽W7ff的自组装纳米结构，采用如下方法制得：将如上所述的自组装抗菌肽W7ff置于PB缓冲液中，80℃下孵育1h，临界胶束浓度为70μM，获得自组装纳米结构。
[0014]本专利技术的另一目的在于提供如上所述的自组装纳米结构在制备治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌引发的感染性疾病的药物中的应用。
[0015]进一步的，所述的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌；所述的革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。
[0016]本专利技术具有如下优点：通过本方法制备的抗菌肽W7ff，Fmoc基团与具有芳香性侧链的色氨酸共同诱导七肽重复序列自组装形成纳米结构，合成过程简单，对该抗菌肽进行自组装能力、杀菌活性、溶血活性测定，发现W7ff在PB缓冲液中自组装能力较强。组装后的W7ff在透射电镜下可以观察到清晰的纤维状结构。组装后的W7ff在较低的浓度下对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌均有很强的杀灭作用，且杀菌效果强于组装前的W7ff；W7ff的溶血率随着肽浓度的增加而升高，浓度小于64μM时溶血率低于10％，在最小抑菌浓度范围内无溶血现象出现，有良好的生物相容性。通过机理试验发现，组装前后的W7ff均作用于细菌细胞膜，发挥抗菌活性。综上所述，本专利技术的抗菌肽W7ff具有自组装能力，是一条拥有较好抑菌活性的抗菌肽，具有成为抗菌药物的潜力，有很高的应用价值。
附图说明
[0017]图1抗菌肽W7ff的反相高效液相色谱图；
[0018]图2抗菌肽W7ff的质谱图；
[0019]图3抗菌肽W7ff的在水和PB的1,8
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ANS荧光光谱图，(a)水环境，(b)PB环境；
[0020]图4抗菌肽W7ff的临界胶束浓度,(a)水环境，(b)PB环境,；
[0021]图5抗菌肽W7ff的透射电镜图，(a)水环境，(b)PB环境；
[0022]图6组装前后W7ff的溶血活性图；
[0023]图7组装前后W7ff与LPS的亲和能力图；
[0024]图8组装前后W7ff对E.coli ATCC25922外膜通透性的影响图。
具体实施方式
[0025]下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。
[0026]实施例1
[0027]具有7个氨基酸残基的重复序列为“abcdefg”，可形成α
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螺旋线圈，其中“a”和“d”位置上的疏水残基选择色氨酸，而其他位置的氨基酸则选择带有正电荷的精氨酸，为多肽提供足够正电荷。引用D型苯丙氨酸进一步提高抗菌肽的稳定性。在保证正电荷和疏水性足够的前提下，Fmoc基团与具有芳香性侧链的色氨酸共同诱导该抗菌肽自组装形成纳米结构。所得的抗菌肽命名为W7ff，抗菌肽序列如表1所示。
[0028]表1抗菌肽W7ff的氨基酸序列
[0029][0030]实施例2
[0031]固相化学合成法合成W7ff抗菌肽
[0032]1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc
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X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后用哌啶脱保护反应30min后，去除哌啶，并用二甲基甲酰胺(DMF)清洗并检测脱保护颜色。再将Fmoc
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Y
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Trt
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OH(9
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芴甲氧羧基
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三甲基
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Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)按照多肽中氨基酸的顺序依次从C端合成到N端，直至合成完毕；
[0033]2、在上述得到的肽树脂中，加入二氯甲烷(DCM)反应30min，用DMF洗涤3遍后检测，确定所有氨基酸已正确连接。将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，
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20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽。
[0034]3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH＝7.4)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Fmoc基团诱导的自组装抗菌肽W7ff，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，分子式如式(I)所示：所述的Fmoc基团为9
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芴甲氧羰基，序列中苯丙氨酸为D型苯丙氨酸。2.根据权利要求1所述的一种基于Fmoc基团诱导的自组装抗菌肽W7ff的制备方法，步骤如下：(1)Fmoc基团连接七肽重复序列，该重复序列“abcdefg”，可形成α
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螺旋线圈，其中“a”和“d”位置上的疏水残基选择色氨酸，而其它位置的氨基酸则选择带有正电荷的精氨酸，为多肽提供足够正电荷；引用D型苯丙氨酸进一步提高抗菌肽的稳定性，在保证正电荷和疏水性足够的前提下，Fmoc基团与具有芳香性侧链的色氨酸能够共同诱导...

【专利技术属性】
技术研发人员：李仲玉，谭美姝，薛萌，吕银凤，侯文婧，单安山，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：