一种体外高效扩增人黏膜相关恒定T细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种体外高效扩增人黏膜相关恒定T细胞的方法，包括：1)将人外周血单个核细胞或人MAIT细胞重悬于不含外源物质及血清的T细胞扩增培养基中，同时培养体系中添加免疫细胞血清补充物、IL

【技术实现步骤摘要】
一种体外高效扩增人黏膜相关恒定T细胞的方法


[0001]本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种体外高效扩增人黏膜相关恒定T细胞的方法。

技术介绍

[0002]黏膜相关恒定T(Mucosa
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associated invariant T,MAIT)细胞是一类固有T细胞，广泛分布在肝脏、肺和胃肠道等粘膜组织，以及外周血(Peripheral blood,PB)中。MAIT细胞有直接清除细菌的作用，此外凭借其多能性发挥诸多免疫调节作用，如对抗病毒/细菌感染、维持粘膜免疫稳态、促进组织修复以及抗肿瘤等。然而，作为科学实验的一种重要手段，实验用大、小鼠由于MAIT细胞比率较低，极难用于进一步研究。不仅如此，大、小鼠MAIT细胞的表型和生物学功能等并不能与人源MAIT细胞完全等同。由于目前缺乏体内、外扩增人源组织MAIT细胞的有效手段，诸多研究者仅能浅显分析MAIT细胞和诸多疾病的相关性，其中包括感染性疾病(如脓毒症)、自身免疫性疾病(炎症性肠病、多发性硬化症)以及代谢性疾病(如糖尿病、脂肪性肝病)等。如需进一步研究MAIT细胞在人类疾病中的作用，MAIT细胞回输势在必行。因此，亟需体外大量扩增MAIT细胞，进而用于医学研究。因此，确定一种有效从人外周血(或其他组织中)分离、培养、扩增MAIT细胞的方法具有意义。
[0003]寻找到一种强有力的、针对人源组织MAIT细胞的特异性抗原，将有助于体外对人源组织MAIT细胞进行特异性增殖，进而更好了解MAIT细胞的生物学功能，为治疗多重疾病提供新的靶点。
[0004]申请人前期研究蝙蝠宿主免疫时，体外应用MAIT细胞最强有力的特异性抗原5
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OP
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RU进行刺激，成功对蝙蝠外周血的MAIT细胞进行体外增殖。尽管均为哺乳动物，人和蝙蝠无论是机体免疫系统应答，还是MAIT细胞的T细胞受体序列均存在巨大差异。不仅如此，抗原提呈细胞(如单核细胞等，用于提呈5
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OP
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RU给MAIT细胞)的比率和功能在人和蝙蝠中均存在不均一性。基于MR1序列在哺乳动物间高度保守这一特征，能否用5
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OP
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RU联合炎症因子体外刺激、增殖人来源的MAIT细胞，且同时保证其活性和生物学功能，用于人类生理或疾病研究尚有待进一步验证。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中的不足，本专利技术旨在提供一种体外高效扩增人黏膜相关恒定T细胞的方法。
[0006]本专利技术的具体技术方案如下：
[0007]本专利技术一方面提供一种体外高效扩增人黏膜相关恒定T细胞的方法，包括如下步骤：
[0008]1)将人外周血单个核细胞或人黏膜相关恒定T细胞重悬于不含外源物质及血清的T细胞扩增培养基中，同时培养体系中添加免疫细胞血清补充物、重组人白介素
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12或重组人白介素
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1b和重组人白介素
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23，进行培养；
[0009]2)在第0、5和10天，向培养体系中加入5
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OP
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RU进行刺激，每2～3天更换T细胞扩增培养基，并补充与步骤1)相同浓度的免疫细胞血清补充物、重组人白介素
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12或重组人白介素
‑
1b和重组人白介素
‑
23，在扩增第11天时，去除死细胞，流式细胞术检测MAIT细胞比率，当人黏膜相关恒定T细胞的细胞比率>70％时，收集细胞。
[0010]进一步地，所述人黏膜相关恒定T细胞分离自人外周血或组织器官。
[0011]进一步地，步骤1)的培养体系中还添加庆大霉素和Normocin；
[0012]优选地，所述庆大霉素的浓度为50μg/mL；
[0013]优选地，所述Normocin的浓度为100μg/mL。
[0014]进一步地，步骤1)的培养体系中，所述免疫细胞血清补充物的终浓度为8％；
[0015]所述重组人白介素
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12或重组人白介素
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1b的浓度5～10ng/mL；
[0016]所述重组人白介素
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23的浓度为5～10ng/mL。
[0017]进一步地，步骤2)培养体系中加入的5
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OP
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RU终浓度为2～10nM；
[0018]所述5
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OP
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RU采用不含外源物质及血清的T细胞扩增培养基进行稀释；
[0019]所述5
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OP
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RU稀释和向培养体系的加入的过程，控制时间不超过5min；
[0020]优选地，加入的5
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OP
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RU终浓度为10nM。
[0021]进一步地，所述方法还包括对收集细胞采用Vα7.2磁珠进行提纯。
[0022]本专利技术另一方面提供所述方法扩增获得的人黏膜相关恒定T细胞。
[0023]本专利技术另一方面提供所述的人黏膜相关恒定T细胞在制备治疗如下之一疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病包括：
[0024]1)感染性疾病；
[0025]2)自身免疫性疾病；
[0026]3)代谢性疾病；
[0027]4)肿瘤。
[0028]进一步地，所述感染性疾病包括脓毒症、病毒和细菌感染；
[0029]所述自身免疫性疾病包括炎症性肠病和多发性硬化症；
[0030]所述代谢性疾病包括糖尿病和脂肪性肝病。
[0031]本专利技术另一方面提供所述的人黏膜相关恒定T细胞作为细胞模型在研究人黏膜相关恒定T细胞在人类疾病中作用的应用。
[0032]进一步地，所述人类疾病包括感染性疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病和肿瘤；
[0033]优选地，所述感染性疾病包括脓毒症、病毒和细菌感染；
[0034]所述自身免疫性疾病包括炎症性肠病和多发性硬化症；
[0035]所述代谢性疾病包括糖尿病和脂肪性肝病。
[0036]本专利技术的有益效果为：
[0037]本专利技术提供一种体外高效扩增人黏膜相关恒定T细胞的方法，通过5
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(2
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氧代氧亚丙基氨基)
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(d
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核糖胺基)尿嘧啶(5
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(2
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oxopropylideneamino)
‑6‑
d
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ribitylaminouracil,5
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OP
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RU)、重组人白介素
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12或重组人白介素
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1b和重组人白介素
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23进行协同刺激人外周血单个核细胞或MAIT细胞，对于MAIT细胞比率小于5％的受试者同样可有效进行体外扩增，第10天MAIT细胞比本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外高效扩增人黏膜相关恒定T细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将人外周血单个核细胞或人黏膜相关恒定T细胞重悬于不含外源物质及血清的T细胞扩增培养基中，同时培养体系中添加免疫细胞血清补充物、重组人白介素
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12或重组人白介素
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1b和重组人白介素
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23，进行培养；2)在第0、5和10天，向培养体系中加入5
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OP
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RU进行刺激，每2～3天更换T细胞扩增培养基，并补充与步骤1)相同浓度的免疫细胞血清补充物、重组人白介素
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12或重组人白介素
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1b和重组人白介素
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23，在扩增第11天时，去除死细胞，流式细胞术检测MAIT细胞比率，当人黏膜相关恒定T细胞的细胞比率>70％时，收集细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人黏膜相关恒定T细胞分离自人外周血或组织器官。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)的培养体系中还添加庆大霉素和Normocin；优选地，所述庆大霉素的浓度为50μg/mL；优选地，所述Normocin的浓度为100μg/mL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)的培养体系中，所述免疫细胞血清补充物的终浓度为8％；所述重组人白介素
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12或重组人白介素
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1b的浓度为5～10ng/mL；所述重组人白介素
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23的浓度为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文森，韩菲，薛怡婷，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：