一种基于CRISPR/Cas12a磁弛豫传感器检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法技术

本发明专利技术涉及食品安全分析技术领域。本发明专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas12a磁弛豫传感器检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：提取待检样品的基因组DNA；制备MNP

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas12a磁弛豫传感器检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法


[0001]本专利技术涉及食品安全分析
，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas12a磁弛豫传感器检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法。

技术介绍

[0002]耐药菌引起的感染已成为公共卫生面临的最大挑战之一。如果不努力遏制抗生素耐药性，预计到2050年，这一数字将达到1000万。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin
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resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是最常见和最广泛存在的耐药细菌，可导致显著的死亡率和发病率。目前已从牛奶、生肉、鸡蛋等众多食品中分离出MRSA菌株，该菌株可能在整个食品生产链中传播，对食品安全构成严重威胁。快速准确的检测MRSA是预防其危害和跟踪其流行病学的前提。
[0003]目前，MRSA的检测方法主要包括分子检测和非分子检测。非分子检测中，基于培养法的抗菌药物敏感性测试准确性高，但是该方法通常需要较长的时间(1～2天)。此外，可通过抗原抗体乳胶凝集试验，使用抗PBP2a抗体检测编码蛋白PBP2a实现MRSA的检测。这种方法简单、省时、易于判断，但最大的缺点是稳定性和分辨率较低。基质辅助激光解吸
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电离飞行时间质谱法(MALDI
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TOF MS)是最有前途的直接鉴定阳性血培养中病原体的非基因型技术之一。该方法通过对比从细菌或真菌样本中获得的蛋白质谱与从特征微生物中获得的谱数据库实现MRSA的鉴定。然而，由于MALDI
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TOF MS的性能很大程度上取决于微生物的纯度和数量，因此需要阳性血液培养的细菌富集和纯化程序。分子检测中，核酸扩增法被广泛用于MRSA的检测。其中，聚合酶链式反应(PCR)是分子手段检测MRSA的金标准。虽然基于PCR的方法具有高灵敏度，但其操作步骤繁琐、耗时长、且需要专业的技术人员和仪器设备。等温核酸扩增方法(如LAMP)不需要热循环系统，但是它的引物设计复杂，灵敏度不足以检测超低含量的MRSA。因此，迫切需要开发快速、低成本、高灵敏度的传感方法来识别MRSA。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas12a磁弛豫传感器检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，为动物源性食品安全提供新的检测方法。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas12a的磁弛豫传感器检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：
[0007](1)提取待检样品的基因组DNA；
[0008](2)将Cas12a蛋白、crRNA和1
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NE buffer r2.1混合，孵育得到crRNA
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Cas12a复合物；
[0009](3)利用固相RCA制备MNP
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ploy
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ALP；
[0010](4)将MNP
‑
ploy
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ALP、待检样品的基因组DNA和RNAase抑制剂混合，得到物料1；
[0011](5)将crRNA
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Cas12a复合物和物料1混合，孵育后磁分离，在上清液中加入磷酸化抗坏血酸酯，孵育得到物料2；
[0012](6)将物料2、Cu(II)溶液、叠氮
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MNP偶联物溶液和炔基
‑
MNP偶联物溶液混合，孵育得到物料3；
[0013](7)将物料3磁分离，未结合的叠氮
‑
MNP偶联物作为信号探针，通过测定对应溶液的横向弛豫时间可以计算出待测样品中的目标物含量。
[0014]作为优选，步骤(2)中所述混合后crRNA的终浓度为180～220nM，Cas12a蛋白的终浓度为230～270nM，所述孵育的条件为35～39℃孵育10～20min。
[0015]作为优选，步骤(4)中所述MNP
‑
ploy
‑
ALP、待检样品的基因组DNA和RNAase抑制剂的体积比为18～22：4～6：0.2～0.4。
[0016]作为优选，步骤(5)中所述MNP
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ploy
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ALP和物料1的体积比为1：2.5～3.5。
[0017]作为优选，步骤(5)中所述磷酸化抗坏血酸酯的浓度为90～110mM；所述磷酸化抗坏血酸酯的用量为MNP
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ploy
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ALP体积的2～3倍。
[0018]作为优选，步骤(5)中所述磁分离前孵育的条件为35～39℃孵育25～35min；所述磁分离后孵育的条件为35～39℃孵育50～70min。
[0019]作为优选，步骤(6)中所述Cu(II)溶液中Cu(II)的浓度为0.8～1.2mM，所述叠氮
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MNP偶联物溶液中叠氮
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MNP偶联物的浓度为35～45μg/mL，所述炔基
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MNP偶联物溶液中炔基
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MNP偶联物的浓度为75～85μg/mL。
[0020]作为优选，步骤(6)中所述孵育的条件为23～27℃孵育8～12min。
[0021]作为优选，步骤(6)中所述孵育时采用pH为3.8～4.2的NaAc
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HAc缓冲体系。
[0022]作为优选，步骤(6)中所述叠氮
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MNP偶联物的粒径为25～35nm，所述炔基
‑
MNP偶联物的粒径为950～1050nm。
[0023]本专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas12a的磁弛豫传感器检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：提取待检样品的基因组DNA；制备MNP
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ploy
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ALP并利用靶标激活的Cas12a对其进行反式切割；磁分离，上清液中加入磷酸化抗坏血酸酯；加入Cu(II)、叠氮
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MNP偶联物和炔基
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MNP偶联物；磁分离，未结合的叠氮
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MNP偶联物作为信号探针，测定对应溶液的横向弛豫时间计算待测样品中的目标物含量。本专利技术无需进行核酸预扩增即可实现MRSA的高灵敏检测，避免了传统靶标核酸扩增所带来的交叉污染风险，为食品安全中MRSA的检测提供了高灵敏、准确、快速的方法。本专利技术应用不同粒径大小超顺纳米磁颗粒在磁场中分离速度的差异，将小粒径的超顺纳米磁颗粒作为信号探针，通过级联固相RCA放大，CRISPR/Cas12a切割和酶介导的点击放大反应，来增强由靶标导致的T2信号的改变程度，从而实现MRSA的高灵敏免靶标扩增检测。该方法充实了CRISPR检测的工具箱，通过将crRNA替换成对应靶标的互补序列，该C
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MRS生物传感器还可以扩展到检测其他耐药细菌，为灵敏、准确地检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas12a磁弛豫传感器检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待检样品的基因组DNA；(2)将Cas12a蛋白、crRNA和1
×
NE buffer r2.1混合，孵育得到crRNA
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Cas12a复合物；(3)利用固相RCA制备MNP
‑
ploy
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ALP；(4)将MNP
‑
ploy
‑
ALP、待检样品的基因组DNA和RNAase抑制剂混合，得到物料1；(5)将crRNA
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Cas12a复合物和物料1混合，孵育后磁分离，在上清液中加入磷酸化抗坏血酸酯，孵育得到物料2；(6)将物料2、Cu(II)溶液、叠氮
‑
MNP偶联物溶液和炔基
‑
MNP偶联物溶液混合，孵育得到物料3；(7)将物料3磁分离，未结合的叠氮
‑
MNP偶联物作为信号探针，通过测定对应溶液的横向弛豫时间可以计算出待测样品中的目标物含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述混合后crRNA的终浓度为180～220nM，Cas12a蛋白的终浓度为230～270nM，所述孵育的条件为35～39℃孵育10～20min。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述MNP
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ploy
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ALP、待检样品的基因组DNA和RNAase抑制剂的体积比为18～22：4～6：0....

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翊平，魏露雨，王知龙，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：