负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种负载聚多巴胺的细胞外囊泡及制备方法，该纳米靶向治疗平台包括源自M2型RAW264.7巨噬细胞的细胞外囊泡和被包裹在所述细胞外囊泡内作为有效治疗成分的聚多巴胺纳米颗粒。本发明专利技术的纳米靶向治疗平台通过使用IL

【技术实现步骤摘要】
负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡及制备方法


[0001]本专利技术涉及动脉粥样硬化治疗的
，具体涉及一种细胞外囊泡
‑
聚多巴胺纳米靶向治疗平台，即负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡及制备方法。

技术介绍

[0002]本专利技术对于
技术介绍
的描述属于与本专利技术相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本专利技术的
技术实现思路
，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本专利技术在首次提出申请的申请日的现有技术。
[0003]动脉粥样硬化是心血管疾病的主要诱因，心血管疾病是全球发病率和死亡率的主要原因之一。炎症不仅是动脉粥样硬化的关键指标，而且还推动了整个疾病的进展。因此，抗炎被认为是治疗动脉粥样硬化的一种有前途的策略。
[0004]然而抗炎药物缺乏针对炎症部位的特异性靶向能力，通常半衰期较差，不仅影响其实际治疗效果，而且会产生许多副作用，甚至导致死亡。而具有抗炎功效的纳米材料，也因为自身的免疫原性、毒性和生物分布问题，在炎症治疗中的应用受到限制。

技术实现思路

[0005]本专利技术实施例的目的是提供一种负载聚多巴胺的细胞外囊泡及制备方法，本专利技术的方法纳米囊泡的尺寸可控，回收率高。
[0006]本专利技术实施例的目的是通过如下技术方案实现的：
[0007]一种负载聚多巴胺的细胞外囊泡的制备方法，包括如下步骤：
[0008]通过使用IL
‑
4和IL
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10细胞因子处理RAW264.7巨噬细胞，使其极化为M2型巨噬细胞；
[0009]将聚多巴胺纳米颗粒与M2型巨噬细胞共孵育后，获取负载聚多巴胺纳米颗粒的来源于M2型巨噬细胞的具有靶向炎症区域的细胞外囊泡。
[0010]进一步的，所述的获取负载聚多巴胺纳米颗粒的来源于M2型巨噬细胞的具有靶向炎症区域的细胞外囊泡通过尺寸连续挤压法连续挤压与聚多巴胺纳米颗粒共孵育的M2型巨噬细胞获得。
[0011]进一步的，将聚多巴胺纳米颗粒负载于所述的细胞外囊泡采用的是尺寸连续挤压法。
[0012]进一步的，所述的M2型巨噬细胞经IL
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4和IL
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10细胞因子处理RAW264.7巨噬细胞后获得，以至少1
×
107个细胞/ml的细胞数量与100ug/mL的聚多巴胺纳米颗粒共同孵育在细胞培养箱中。
[0013]进一步的，所述的将聚多巴胺纳米颗粒负载于所述的纳米细胞外囊泡具体包括如下步骤：将聚多巴胺纳米颗粒添加进M2型巨噬细胞培养体系中共孵育后，使用细胞刮刀将细胞收集，并使用微型挤压器将细胞悬浮液依次通过1μm、400nm和200nm聚碳酸酯膜挤出，连续挤出五到六次后，使用PBS清洗并离心，以去除未被负载的聚多巴胺纳米颗粒，最后获
取的即为负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡。
[0014]一种负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡，所述的负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡由权利要求1
‑
5任一项所述的制备方法制备而得。
[0015]一种负载褪黑素细胞外囊泡，所述的负载褪黑素细胞外囊泡由上述的制备方法制备而得。
[0016]本专利技术实施例具有如下有益效果：
[0017]本专利技术方法在纳米原材料的选择上，选择M2型巨噬细胞作为囊泡来源的材料，M2型巨噬细胞本身具有靶向炎症环境的能力，同时含有丰富的抗炎因子，而其来源的囊泡不仅富含了亲本细胞的生物活性物质，同样具有主动靶向炎症环境的能力，也拥有更好的生物相容性和免疫逃避能力，增强治疗效果。
[0018]在制备方法上，采用连续挤压法这种物理获取囊泡的方法实现获取囊泡的尺寸大小可控性以及高获取率，简化了获取囊泡的过程同时降低了成本。
[0019]在功能上，纳米囊泡不仅作为载体可以将抗氧化纳米颗粒聚多巴胺递送至炎症病变部位，延长体内循环时间，同时M2型巨噬细胞来源的纳米囊泡还具有抗炎功效，结合抗炎颗粒的递送，能够实现一次递送达到双重治疗效果。
[0020]本专利技术的制备方法简单有效，M2型巨噬细胞获取简单，连续挤压的物理方法操作简单，可以进行大量制备。
附图说明
[0021]图1为本专利技术负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡及其制备方法中通过使用使用IL
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4和IL
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10细胞因子共同处理RAW264.7巨噬细胞24小时后获取的M2型巨噬细胞的蛋白表达图。即通过WesterBlot实验观察得到的M2型巨噬细胞的蛋白标记物Arg1的表达上调，而M1型巨噬细胞的蛋白标记物iNOS的表达下调，说明成功获取M2型巨噬细胞。(Arg1:精氨酸酶1；iNOS:诱导型一氧化氮合成酶；Actin:肌动蛋白；M0:未刺激活化的巨噬细胞；M2:替代活化型巨噬细胞)。
[0022]图2为本专利技术负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡及其制备方法中通过的聚多巴胺纳米颗粒的透射电镜图。通过透射电镜说明其形态球形，大小尺寸均一，分布均匀，也进一步说明聚多巴胺纳米颗粒适合被装载进入同样呈球形的细胞外囊泡。
[0023]图3为本专利技术负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡及其制备方法中将聚多巴胺纳米颗粒与M2型巨噬细胞共孵育的混合物经过连续尺寸排阻进行连续挤压后获得的负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡。通过透射电镜说明负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡的大小尺寸的均一性。可由透射电镜观察到聚多巴胺纳米颗粒的周围包裹上一层透明的双层脂质膜结构，即为双层膜结构的细胞外囊泡，囊泡内即为装载的聚多巴胺纳米颗粒。
[0024]图4为本专利技术负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡及其制备方法中负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡发挥其抗氧化能力的共聚焦图。通过对H2O2(1mM)处理24小时的巨噬细胞即泡沫细胞施加干预的细胞实验可以观察到，负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡(PDA@M2NVs)具有优异的抗氧化特性，通过DCFH
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DA、JC
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1以及MitoSox实验的共聚焦显微镜观察，可以观察到PDA@M2NVs处理过的细胞，其DCFH
‑
DA探针的绿色信号值较单独的聚多巴胺纳米颗粒(PDANPs)下降的更为明显，说明细胞的活性氧含量经过干预后下降；JC
‑
1探针
实验也可以观察到红色荧光信号在PDA@M2NVs处理后明显高于PDANPs处理过后的信号值，同时MitoSox红色荧光在PDA@M2NVs组低于PDANPs，均可以说明细胞内线粒体的活性氧含量经过PDA@M2NVs干预后下降的更为明显。因而可以得出负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡的处理能够使得H2O2处理的巨噬细胞的活性氧降低，发挥抗氧化功能。
[0025]图5为本专利技术负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡及其制备方法中负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡主动靶向动脉粥样硬化斑块验证区域的荧光图。通过离体血管的荧光成像的观察，可以发现，负载聚多巴胺纳米颗粒的细胞外囊泡，即PDA@M2NVs的尾静脉注射后，PDA@M2NV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种负载聚多巴胺的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：通过使用IL
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4和IL
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10细胞因子处理RAW264.7巨噬细胞，使其极化为M2型巨噬细胞；将聚多巴胺纳米颗粒与M2型巨噬细胞共孵育后，获取负载聚多巴胺纳米颗粒的来源于M2型巨噬细胞的具有靶向炎症区域的细胞外囊泡。2.根据权利要求1所述的负载聚多巴胺纳米颗粒细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述的获取负载聚多巴胺纳米颗粒的来源于M2型巨噬细胞的具有靶向炎症区域的细胞外囊泡通过尺寸连续挤压法连续挤压与聚多巴胺纳米颗粒共孵育的M2型巨噬细胞获得。3.根据权利要求2所述的负载聚多巴胺纳米颗粒细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，将聚多巴胺纳米颗粒负载于所述的细胞外囊泡采用的是尺寸连续挤压法。4.根据权利要求1所述的负载聚多巴胺纳米颗粒细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述的M2型巨噬细胞经IL
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【专利技术属性】
技术研发人员：曹丰，张阳，刘鐘阳，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院第二医学中心，
类型：发明
国别省市：