一种光敏细胞外小囊泡及制备方法、应用和药物技术

本发明专利技术公开了一种光敏细胞外小囊泡及制备方法、应用和药物，属于纳米药物载体领域，包括如下步骤：从BALB/c小鼠骨髓提取原代骨髓间充质干细胞；利用光学显微镜、流式细胞仪鉴定原代骨髓间充质干细胞；利用“经典的差速超速离心法”从细胞培养上清液中提取骨髓间充质干细胞分泌的细胞外小囊泡；利用电穿孔的方法将水溶液中的Ce6和GW4869同时载入细胞外小囊泡；穿孔后在冰上孵育15分钟，后将混合液放入细胞培养箱孵育1小时，以促进细胞外小囊泡膜修复；100000g超速离心除去游离的Ce6和GW4869，得到能够改善三阴性乳腺癌免疫微环境的光敏细胞外小囊泡。制得的复合细胞外小囊泡中Ce6和GW4869的载药量能满足体内治疗要求为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的工具。三阴性乳腺癌的治疗提供了新的工具。三阴性乳腺癌的治疗提供了新的工具。

【技术实现步骤摘要】
一种光敏细胞外小囊泡及制备方法、应用和药物


[0001]本专利技术涉及纳米药物载体领域，具体涉及一种光敏细胞外小囊泡及制备方法、应用和药物。

技术介绍

[0002]光动力治疗作为一种新型非侵入性的临床治疗手段，目前已有多款光敏剂被多国的FDA批准在临床上应用。Ce6(Chlorin e6，二氢卟吩e6)作为一种光动力治疗常用的光敏剂，在660nm波长的光照下具有较强的抗肿瘤作用。GW4869是中性鞘磷脂酶抑制剂(GW4869)，体外实验发现，GW4869可以抑制三阴性乳腺癌细胞分泌细胞外小囊泡，而三阴性乳腺癌细胞分泌的细胞外小囊泡可以刺激免疫抑制性细胞如：Tregs和MDSCs的成熟，因此GW4869抑制三阴性乳腺癌细胞分泌细胞外小囊泡可以减少免疫抑制性细胞的成熟，故其具有改善三阴性乳腺癌免疫微环境的能力。
[0003]然而两种药物均有明显的缺陷，比如：在血液循环系统中溶解性、稳定性差，容易被单核巨噬细胞吞噬，往往较多地聚集在肝脾及淋巴组织，肿瘤部位的浓度较低，影响其抗肿瘤的效果。用合适的载体对药物进行包载，提高其在血循环中的溶解性、稳定性，避免/减少免疫清除。因此，为了能够更多的将目标药物递送至三阴性乳腺癌区域，并实现光动力治疗和GW4869改善三阴性乳腺癌的免疫微环境协同治疗，提出一种光敏细胞外小囊泡及制备方法、应用和药物。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提出了一种光敏细胞外小囊泡及制备方法、应用和药物。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006]一种光敏细胞外小囊泡制备方法，所述的细胞外小囊泡内载有可用于光动力治疗的Ce6以及抑制三阴性乳腺癌细胞外小囊泡分泌的GW4869，其还具有改善三阴性乳腺癌免疫微环境的功能；其中Ce6为水溶液，GW4869为二甲基亚砜(DMSO)溶液，其具体制备步骤如下：
[0007]从BALB/c小鼠的股骨和胫骨中获取其骨髓，在DMEM/F12培养液中培养；其中，原代BALB/c小鼠细胞的骨髓间充质干细胞的培养液为含有无细胞外小囊泡的血清；
[0008]在原代BALB/c小鼠细胞的骨髓间充质干细胞被提取后的第十四天在光学显微镜下观察期形态；
[0009]用流式细胞仪检测原代BALB/c小鼠细胞的骨髓间充质干细胞稳定增殖的第三代细胞表面标志物Sca
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1、CD44、CD45、CD11b和CD31；
[0010]收集稳定传代的原代BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞的上清液，采用“经典的差速超速离心法”，得到的细胞外小囊泡并重悬于PBS溶液中，
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80℃保存备用；其中，每800
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1000mL的上清液在经过“经典的差速超速离心法”处理后获得的细胞外小囊泡用800μL
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1000μL的PBS重悬；
[0011]将Ce6水溶液、含有GW4869的DMSO溶液及4)中获取的细胞外小囊泡混悬液加入PBS溶液中，充分混匀后获得样品；其中，细胞外小囊泡以其蛋白含量计，每100μg的细胞外小囊泡的溶液中，Ce6的质量为80
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120μg，GW4869的质量为100
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150μg；
[0012]按电穿孔仪的规格选择合适的电穿孔皿，并加入相应体积的上述样品，放入电穿孔仪中，按照预实验摸索的最佳穿孔条件设定参数，进行穿孔；其中，电穿孔条件为：电压400
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800V，电容125
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200μF，放电时间1
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10ms，放电次数1次；
[0013]穿孔后在冰上孵育15
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20分钟等待药物充分进入细胞外小囊泡中，随后立即将样品放入细胞培养箱中37℃孵育1小时，以促进细胞外小囊泡膜修复；
[0014]上述样品孵育1小时后，以100000
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110000g离心力超速离心70
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110分钟，将上清弃去，沉淀物即为能够改善三阴性乳腺癌免疫微环境的光敏细胞外小囊泡，称之为复合细胞外小囊泡；
[0015]上述复合细胞外小囊泡用PBS重悬，制备铜网样品并进行负染，于电镜下观察细胞外小囊泡的形态，用纳米颗粒跟踪分析检测(NTA)测定其平均粒径及粒径分布范围，用BCA法测细胞外小囊泡的蛋白含量，用Western Blotting检测细胞外小囊泡膜表面特征性蛋白表达，证明其为细胞外小囊泡；
[0016]将部分复合细胞外小囊泡用PBS重悬，用紫外
‑
可见光分光光度计检测400nm及653nm处Ce6的特征性吸收峰以及350nm处GW4869的特征性吸收峰，证明Ce6和GW4869成功负载于细胞外小囊泡内，并根据OD值测定Ce6和GW4869在复合细胞外小囊泡中的含量。
[0017]第二方面，本专利技术还提供一种光敏细胞外小囊泡，通过上述所述的光敏细胞外小囊泡的制备方法制备得到。
[0018]第三方面，本专利技术还提供如上述所述的光敏细胞外小囊泡在制备抗三阴性乳腺癌药物、抗三阴性乳腺癌辅助药物或三阴性乳腺癌诊断药物中的应用。
[0019]第四方面，本专利技术还提供一种药物，包括如上所述的光敏细胞外小囊泡。
[0020]本专利技术的有益效果：
[0021]本专利技术用细胞外小囊泡同时负载Ce6和GW4869，制得的复合细胞外小囊泡一方面增加了两种药物的溶解性、稳定性，降低了药物在活体应用时的被免疫系统的吞噬和清除可能；另一方面，由于该复合细胞外小囊泡保持了其纳米级别的粒径，活体应用时可以对肿瘤进行靶向治疗，保证药物的体内给药效率，实现了对肿瘤的精准治疗并减少其副作用。同时，该专利技术具有明确的理论基础，成熟的实验方法和简便易行的操作流程。
附图说明
[0022]下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。
[0023]图1为本申请的原代BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞在第十四天的光学显微镜下的示意图；
[0024]图2为本申请的流式实验检测原代BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞增殖的第三代细胞表面标志物的表达情况图；
[0025]图3为本申请的电穿孔前、后透射电镜(TEM)观察细胞外小囊泡大小和形貌特征图；
[0026]图4为本申请的电穿孔前、后纳米颗粒跟踪分析(NTA)测量细胞外小囊泡粒径大小及分布图；
[0027]图5为本申请的电穿孔前、后细胞外小囊泡特征性蛋白表达情况(Western Blotting)图；
[0028]图6为本申请的电穿孔前、后细胞外小囊泡紫外
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可见光分光光谱图。
具体实施方式
[0029]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种光敏细胞外小囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将细胞外小囊泡、Ce6水溶液和含有GW4869的DMSO溶液加入PBS溶液，混均后进行电穿孔；电穿孔后，在冰上孵育15
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20分钟，然后将混合溶液在温度为37℃的条件下孵育1小时；孵育结束后提取混合溶液中的沉淀物，沉淀物即为细胞外小囊泡。2.根据权利要求1所述的光敏细胞外小囊泡的制备方法，其特征在于，所述细胞外小囊泡以其蛋白含量计，每100μg的细胞外小囊泡的溶液中，Ce6的质量为80
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120μg，GW4869的质量为100
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150μg。3.根据权利要求1所述的光敏细胞外小囊泡的制备方法，其特征在于，所述细胞外小囊泡从BALB/c小鼠细胞的骨髓间充质干细胞获取。4.根据权利要求1所述的光敏细胞外小囊泡的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁一楠，唐秋莎，余卫平，邵国良，王陆鸿，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：