一种提高甲基杆菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法技术

本发明专利技术属于生物化工技术领域，具体为一种提高甲基杆菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法包括：配置基础培养基溶液；向基础培养基溶液中添加一定量的S

【技术实现步骤摘要】
一种提高甲基杆菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法


[0001]本专利技术属于生物化工
，具体涉及一种提高甲基营养菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法。

技术介绍

[0002]吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)在研究非磷酸化细菌的葡萄糖代谢过程中发现。二十世纪七十年代Durine首次分离出PQQ，随后Salisbury等人通过核磁等手段表征分析后对其结构进行了鉴定。2004年Kay等人通过绿脓假单胞菌产生PQQ的研究发现它是细菌脱氢酶氧化还原辅因子，是一种新型辅酶。吡咯喹啉醌是目前发现的四种醌式辅酶之一，参与氧化还原反应。PQQ是一种小分子化合物，分子中含有参与氧化还原反应的邻醌类结构，参与脱氢、氧化、水合和脱羧等反应，在微生物、动植物、人体以及食物中广泛存在，具有重要的生物学功能和巨大的经济价值。
[0003]无论对PQQ深入研究还是对PQQ巨大潜力的发掘应用，高效分离制备PQQ是一道巨大的障碍。目前从太岁“肉灵芝”中提取PQQ，受资源限制不可持续；化学合成法方法繁杂，合成步骤较多，提取效率不高，生产成本高，反应过程中有重金属参与，对环境产生巨大破坏；因此生物合成法制备PQQ成为未来发展的方向。
[0004]目前，PQQ主要存在于革兰氏阴性细菌中，少数革兰氏阳性细菌中也能产生PQQ，野生菌合成PQQ含量极低。PQQ生产菌种主要包括重组大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌、氧化葡萄糖酸杆菌等。而生产PQQ的野生菌有：甲基单胞菌属、假单胞菌属、甲基菌属、噬甲基菌属、甲基杆菌属、交替单胞菌属以及微环菌属等。其中合成PQQ最多的是甲基营养型细菌。

技术实现思路

[0005]鉴于此，本专利技术提供一种提高甲基营养菌发酵吡咯喹啉醌产量的方法，以解决现有技术中存在的菌株发酵PQQ产量低的问题。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]本专利技术提供一种提高甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌产量的方法，其特征在于，包括：步骤一：配置基础培养基溶液；步骤二：向基础培养基溶液中添加一定量的S
‑
腺苷甲硫氨酸、月桂酰基谷氨酸钠和钙盐构成培养基溶液；步骤三：向灭灭菌处理后培养基溶液中添加发酵菌种；步骤四：在一定温度和转速下发酵。
[0008]在上述的提高甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌产量的方法中，作为优选的方案，所述步骤一中的基础培养基溶液按质量份数计包括：水1000份、甲醇5
‑
10份、Na2HPO42份；Na2HPO41.4份、MgSO4·
7H2O 1份、硫酸铵5份和微量元素溶液0.5
‑
2份。
[0009]在上述的提高甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌产量的方法中，作为优选的方案，所述微量元素溶液按质量份数计包括：水1000000份、FeSO4·
7H2O 80
‑
100份、ZnSO4·
7H2O 20
‑
30份、KI 0.09
‑
0.59份、H3BO
3 1
‑
5份、CuSO4·
5H2O 2
‑
8份和NaCl 10
‑
20份。
[0010]在上述的提高甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌产量的方法中，作为优选的方案，
所述步骤二中的S
‑
腺苷甲硫氨酸、月桂酰基谷氨酸钠和钙盐按质量份数计为S
‑
腺苷甲硫氨酸0.02
‑
0.2份、月桂酰基谷氨酸钠1
‑
3份、钙盐0.3
‑
1份。
[0011]在上述的提高甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌产量的方法中，作为优选的方案，所述钙盐为CaCl2或Ca(NO3)2。
[0012]在上述的提高甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌产量的方法中，作为优选的方案，所述步骤三中的发酵菌种至少为甲基杆菌ACCC 40620、甲基杆菌ACCC 03242、鲍曼不动杆菌ACCC 11038或鲍曼不动杆菌ACCC 01130中的一种。
[0013]在上述的提高甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌产量的方法中，作为优选的方案，所述步骤四中的在一定温度和转速下发酵，实在发酵罐中进行的，其中发酵温度控制在28
‑
36℃，转速控制在180
‑
220r/min范围，发酵时间为30
‑
80h。
[0014]本专利技术提供一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌产量的方法，具有如下有益效果：
[0015]本专利技术通过特定甲醇培养基发酵培养甲基营养菌，并向培养基中添加一定比例的氨基酸表面活性剂月桂酰谷氨酸钠、氨基酸衍生物S
‑
腺苷甲硫氨酸(SAM)以及一定量的钙盐，能够有效地促进吡咯喹啉醌的生产，采用本专利技术的方法，能使吡咯喹啉醌的产量提升10
‑
18倍。
[0016]研究表明：吡咯喹啉醌由pqq基因簇负责合成，该基因簇含有6个基因，经转录翻译生成6个蛋白或多肽。多肽PqqA经PqqE、PqqD酶催化发生偶联反应、PqqF酶水解切割除去多余氨基酸、PqqB、PqqC酶氧化修饰最终生成吡咯喹啉醌，合成路径如图2所示。在环化反应过程中，PqqED酶首先催化S
‑
腺苷甲硫氨酸(SAM)生成单电子自由基，激活多肽PqqA中谷氨酸和酪氨酸残基发生环化偶联反应。因此，本专利技术在该理论研究基础上，通过添加S
‑
腺苷甲硫氨酸(SAM)和月桂酰谷氨酸钠，提高合成通路代谢能力，促进PQQ的合成，提高发酵产量。
[0017]本专利技术可利用低浓度甲醇添加一定的营养物后发酵获得高附加值产品吡咯喹啉醌，甲醇可来源于工业废液，从而达到减少废弃物排放的目的，变废为宝。
附图说明
[0018]图1为本专利技术的反应步骤示意图；
[0019]图2为本专利技术的吡咯喹啉醌的合成路径图；
[0020]图3为本专利技术的PQQ检测标准曲线；
[0021]图4为本专利技术的实施例1发酵液中PQQ色谱图
[0022]图5为本专利技术的PQQ标准品HPLC色谱图；
[0023]图6为本专利技术的发酵液中PQQ纯品质谱图；
[0024]图7为本专利技术的发酵液中PQQ纯品紫外光谱图。
具体实施方式
[0025]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0026]以下结合具体情况说明本专利技术的示例性实施例：
[0027]实施例1
[0028]如图1
‑
图7所示，一种提高甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌产量的方法，其特征在于，包括：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌产量的方法，其特征在于，包括：步骤一：配置基础培养基溶液；步骤二：向基础培养基溶液中添加一定量的S
‑
腺苷甲硫氨酸、月桂酰基谷氨酸钠和钙盐构成培养基溶液；步骤三：向灭灭菌处理后培养基溶液中添加发酵菌种；步骤四：在一定温度和转速下发酵。2.根据权利要求1所述的提高甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌产量的方法，其特征在于，所述步骤一中的基础培养基溶液按质量份数计包括：水1000份、甲醇5
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10份、Na2HPO
4 2份；Na2HPO
4 1.4份、MgSO4·
7H2O 1份、硫酸铵5份和微量元素溶液0.5
‑
2份。3.根据权利要求2所述的提高甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌产量的方法，其特征在于，所述微量元素溶液按质量份数计包括：水1000000份、FeSO4·
7H2O 80
‑
100份、ZnSO4·
7H2O 20
‑
30份、KI 0.09
‑
0.59份、H3BO
3 1
‑
5份、CuSO4·
5H2O 2
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：马科，吴桐，
申请(专利权)人：郑州尼采生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：