用于单细胞基因谱分析的方法和系统技术方案

本公开提供了用于在不使用微流体装置的情况下对靶细胞进行单细胞分析，包含单细胞转录组分析的方法和系统。所公开的方法涉及使用模板颗粒来模板化单分散液滴的形成，以便通常从包封中的细胞群体中捕获单一靶细胞，从该单一靶细胞获得多个不同的mRNA分子，并且对这些不同的mRNA分子进行定量以产生表达谱。不同的mRNA分子进行定量以产生表达谱。不同的mRNA分子进行定量以产生表达谱。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于单细胞基因谱分析的方法和系统


[0001]本公开涉及用于单细胞基因谱分析的方法和系统。

技术介绍

[0002]生物系统的复杂性需要许多实验来表征这些生物系统。通常实施高通量方法以减少需要执行的单独实验的数量。不幸的是，用于单细胞的高通量分析的方法会受到分离单细胞和制备文库相关的成本的限制。
[0003]用于分离单细胞的方法通常需要使用复杂且操作昂贵的微流体装置。此外，由于细胞被单独处理，因此微流体装置在给定实验中可以测定的细胞数量方面固有地受到限制。因此，高通量单细胞系统在许多临床和研究设施中是不可获得的。

技术实现思路

[0004]本公开提供了在不使用无微流体装置的情况下对靶细胞进行单细胞分析，包含单细胞转录组分析的方法和系统。本专利技术的方法和系统产生具有模板颗粒的乳液，以将单独的靶细胞分离成单分散液滴。核酸分子从单分散液滴内部的靶细胞释放并且被定量，以产生靶细胞中的每个靶细胞的表达谱。该方法提供了一种廉价且可扩展的大规模并行的分析工作流程，以利用单个文库制备来确定数百万个单细胞的表达谱。
[0005]本专利技术的方法和系统使用模板颗粒来模板化单分散液滴的形成并且分离用于基因谱分析的靶细胞。方法包含：在第一流体中将模板颗粒与靶细胞合并；向该第一流体中添加第二流体；剪切这些流体以同时产生多个单分散液滴，其中这些单分散液滴中的每个单分散液滴含有这些模板颗粒中的单个模板颗粒和这些靶细胞中的单个靶细胞。方法进一步包含裂解这些单分散液滴内的这些靶细胞以释放多个不同的mRNA分子，以及对这些多个不同的mRNA分子进行定量。通过对该mRNA进行定量产生的数据用于产生这些靶细胞中的每个靶细胞的表达。方法进一步包含处理表达谱以鉴定靶细胞的可以用于例如诊断、预后或确定药物有效性的特性。
[0006]本专利技术的方法和系统提供了一种用于对靶细胞的基因表达进行定量的方法。该方法包含从单分散液滴内部的靶细胞释放mRNA。该mRNA可以逆转录成cDNA并且同时加上条形码。带条形码的cDNA进行扩增以产生多个带条形码的扩增子。扩增子可以通过下一代测序方法进行测序，并且由于条形码，每个序列读段都可以追溯到靶细胞。通过某些计算机算法处理序列读段以产生靶细胞的表达谱。
[0007]在从靶细胞获得表达谱之后，可以通过将这些谱与参照或对照谱进行比较来分析这些谱以确定关于靶细胞的信息。在其它情况下，可以将靶细胞的谱与来源于具有某些表型的细胞的谱进行比较，以确定这些靶细胞是否共享具有该表型的细胞的特性。
[0008]一方面，本专利技术的方法和系统提供了一种用于鉴定异质细胞群体中的稀少细胞的存在的方法。该方法包含通过以下方式分离多个靶细胞：在第一流体中将靶细胞与多个模板颗粒合并；添加与该第一流体不混溶的第二流体；以及剪切这些流体以产生包括含有靶
细胞和单个模板颗粒的单分散液滴的乳液。方法进一步包含释放含有靶细胞的液滴内部的多个mRNA分子以及对这些多个mRNA分子进行定量。定量可以包含将mRNA逆转录成带条形码的cDNA。带条形码的cDNA可以被扩增，以产生可以追溯到靶细胞的多个带条形码的扩增子。在某些情况下，方法可以包含例如通过下一代测序方法对这些多个带条形码的扩增子进行测序以产生序列读段。方法可以进一步包含处理序列读段以产生每个靶细胞的表达谱；以及例如通过进行基因聚类分析来使用数据，以鉴定靶细胞中的一种或多种细胞类型或细胞状态。
[0009]另一方面，本公开的方法和系统提供了一种用于分析取自受试者的异质肿瘤活检的方法。该方法包含从患者获得活检以及从该活检中分离细胞群体。该方法进一步包含：通过产生该细胞群体和多个模板颗粒的混合物水性流体来将该细胞群体分离成液滴；添加油；以及旋转该混合物，以产生包括液滴的乳液，这些液滴各自含有细胞群体中的单个细胞群体以及模板颗粒。该方法进一步包含从液滴内部的细胞中的每个细胞释放mRNA以及对一个或多个基因进行转录组分析。对一个或多个基因的分析可以用于鉴定癌症的一个或多个特性。癌症的特性可以是与癌症相关的一种或多种基因转录物的存在或不存在。本文所公开的方法可以进一步包括使用该特性来诊断患有癌症的受试者并且设计治疗计划的步骤。
[0010]在一些方面，本专利技术的方法和系统提供了一种用于确定治疗剂的潜在有效性的方法。该方法包括将患病细胞的第一群体分离成具有模板颗粒的液滴，以及确定来自这些患病细胞中的至少一个患病细胞的基因表达，由此产生疾病状态表达特征。该方法进一步包含将疾病状态细胞的第二群体暴露于药剂并且确定第二群体细胞的基因表达，以及将该基因表达与疾病状态表达特征进行比较，以基于一种或多种基因的表达的升高的或阻遏的水平确定该药剂对抗疾病的有效性。在一些实施例中，治疗剂可以递送到液滴内部的第二细胞群体。例如，通过将药剂束缚到模板颗粒的外表面，或将药剂包装在模板颗粒的隔室内部并且从液滴内部的模板颗粒释放药剂，药剂可以与模板颗粒缔合。
[0011]在某些方面，本专利技术的方法和系统提供了一种用于将细胞分离成液滴的方法。液滴可以制备为乳液，例如，作为分散在不混溶相载体流体(例如，氟碳油、硅油或烃油)中的水相流体，或反之亦然。通常，这些液滴是通过剪切两个液相形成的。剪切可以包括涡旋、摇动、轻弹、搅拌、移液或用于混合溶液的任何其它类似方法中的任何一种。本专利技术的方法包含在第一流体中将细胞与模板颗粒合并；添加第二流体；以及剪切或搅动该第一流体和第二流体。优选地，该第一流体是水相流体，并且在一些实施例中，可以包括选自以下的试剂：例如，缓冲液、盐、裂解酶(例如，蛋白酶k)和/或其它裂解试剂(例如，Triton X
‑
100、Tween
‑
20、IGEPAL或其组合)、核酸合成试剂(例如，核酸扩增试剂或逆转录混合物)或其组合。
[0012]本专利技术的方法和系统使用模板颗粒来模板化单分散液滴的形成并且分离靶细胞。根据本专利技术的各方面的模板颗粒可以包括水凝胶，该水凝胶例如选自琼脂糖、藻酸盐、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺(PAA)、丙烯酸酯、丙烯酰胺/双丙烯酰胺共聚物基质、叠氮化物改性的PEG、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺和其组合。在某些情况下，模板颗粒可以被成形以提供对靶细胞的增强的亲和力。例如，模板颗粒可以是大致球形的，但形状可以含有促进与靶细胞缔合的特征，如平坦表面、凹坑、凹槽、凸出和球形形状中的其它不规则部，使得模板颗粒的形状增加了模板化含有靶细胞的液滴的可能性。
[0013]在某些方面，本专利技术的方法和系统提供了包含一个或多个内部隔室的模板颗粒。
内部隔室可以含有可在外部刺激下释放的试剂或化合物。模板颗粒所含有的试剂可以包含例如细胞裂解试剂或核酸合成试剂(例如，聚合酶)。外部刺激可以是热、渗透压或酶。例如，在一些情况下，本专利技术的方法包含在含有mRNA的液滴内部直接释放逆转录酶。
[0014]在一些方面，本专利技术的方法和系统提供了一种用于分析单细胞的转录组的文库制备方法。方法包含从液滴内部所含有的单一靶细胞释放mRNA。在一些实施例中，所释放的mRNA通过互本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于单细胞分析的方法，所述方法包括：在第一流体中将模板颗粒与靶细胞合并；向所述第一流体中添加第二流体；剪切所述流体以同时产生多个单分散液滴，所述多个单分散液滴含有所述模板颗粒中的单个模板颗粒和所述靶细胞中的单个靶细胞；裂解所述单分散液滴内所含有的单一靶细胞中的每个单一靶细胞，以释放多个不同的mRNA分子；以及对所述多个不同的mRNA分子进行定量。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在对所述多个不同的mRNA分子进行定量之后，产生所述单一靶细胞中的每个单一靶细胞的表达谱。3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括逆转录所述液滴内部的所述多个不同的mRNA分子。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一流体是水性流体。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第二流体包括油。6.根据权利要求5所述的方法，其中剪切所述流体包括使用涡旋器或移液中的一种。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述模板颗粒进一步包括一个或多个隔室。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一个或多个隔室含有选自包括裂解试剂、核酸合成试剂或其组合的组的试剂。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述核酸合成试剂包括聚合酶。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述试剂响应于外部刺激而从所述一个或多个隔室释放。11...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：福路伦特生物科学公司，
类型：发明
国别省市：