一种纤连蛋白突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种纤连蛋白突变体及其应用，涉及生物医药技术领域。所述纤连蛋白突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，且纤连蛋白突变体为选取纤连蛋白与细胞增殖、迁移活性密切相关的结构域，构建纤连蛋白突变体D89，并对纤连蛋白突变体D89的核苷酸进行两步优化来获得。本发明专利技术克服了现有技术的不足，通过纤连蛋白突变体制备的重组纤连蛋白D89具有良好的促细胞增殖和促细胞迁移的效果，便于后续对相应药物的开发，同时对本领域实验研究提供良好的导向。同时对本领域实验研究提供良好的导向。同时对本领域实验研究提供良好的导向。

【技术实现步骤摘要】
一种纤连蛋白突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种纤连蛋白突变体及其应用。

技术介绍

[0002]纤连蛋白是一种细胞外基质（ECM）的粘附分子，其广泛存在于血液、体液及各类组织中的高分子糖蛋白。分子量为450kda，由两个220kda的亚基通过二硫键连接形成。亚基有6个致密球状体构成，每个区域都有特定的功能可以与特殊的配体结合，具有多种生物学功能。FN中至少存在两个独立于细胞附着区域，其一是在FN中心位置，具有两个协同作用的氨基酸序列ARG
‑
GLY
‑
ASP（RGD）和PRO
‑
HIS
‑
ARG
‑
ASN（PHRSN），另一个在羧基端附近，IIICS交替拼接，关键小序列是LEU
‑
ASP
‑
VAL（LDV）和ARG
‑
GLU
‑
ASP
‑
VAL（REDV）。RGD是α5β1、αvβ3、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α8β1整合素的常见结合位点。有研究表明，当细胞同时存在αVβ1与α5β1时，才能够促进细胞增殖。FN基因位于2号染色体上75kb左右，拥有50个左右的外显子，基因序列的90%以上都是通过FNI型II型III型重复排列组成。它的主要结构和排列方式从（N
‑
C）端依次为：
①
6个FNI
②
2个FNII
③
3个FNI
④
14个FNIII
⑤
V区（IIICS区）
⑥
1个FNIII
⑦
3个FNI。
[0003]纤连蛋白是细胞外基质的重要组成部分，通过与细胞表面受体及细胞外基质分子的相互作用，促进细胞粘附、迁移，促进创伤修复，因此，纤连蛋白在医学、美容、护肤领域有广泛的应用前景。虽然动物组织、血液中含有纤连蛋白，但是含量极为有限，因此，组织来源的纤连蛋白存在产量低，成本高，产品纯度低的缺点。重组DNA技术通过构建线路蛋白基因的表达载体，在原核或者真核生物中表达、制备高纯度的纤连蛋白。纤连蛋白单体约220~250KDa，分子量较大，研究表明，通过选择纤连蛋白上的部分结构域，重组DNA技术制备含有纤连蛋白部分结构域的突变体，具有纤连蛋白的生物学活性。但是，如何筛选纤连蛋白的活性结构域进行重构，获得高活性、高稳定性的纤连蛋白突变体是制约纤连蛋白应用的关键技术之一。此外，重组蛋白异源表达时，往往表达量低，或者以包涵体形式表达，这也是制约纤连蛋白应用的另一关键技术。

技术实现思路

[0004]针对现有技术不足，本专利技术提供一种纤连蛋白突变体及其应用来解决上述技术问题。
[0005]为实现以上目的，本专利技术的技术方案通过以下技术方案予以实现：一种纤连蛋白突变体，其特征在于，所述纤连蛋白突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO .1。
[0006]优选的，所述纤连蛋白突变体为选取纤连蛋白与细胞增殖、迁移活性密切相关的结构域，构建纤连蛋白突变体D89，并对纤连蛋白突变体D89的核苷酸进行两步优化来获得。
[0007]优选的，所述两步优化的方式为结合大肠杆菌密码子偏好性对纤连蛋白突变体D89的核苷酸序列进行初步优化，同时通过翻译暂停理论对纤连蛋白突变体的核苷酸序列
做进一步的优化。
[0008]优选的，采用所述纤连蛋白突变体制备重组纤连蛋白D89在促细胞增殖、迁移、粘附活性中的应用。
[0009]优选的，所述重组纤连蛋白D89的制备方式为将纤连蛋白突变体结合表达载体构建成重组载体，再将重组载体转化到宿主细胞中进行表达、纯化。
[0010]优选的，所述表达载体为质粒pET
‑
28系列载体，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0011]优选的，所述应用为在制备促进细胞迁移、黏附、增殖、止血及组织修复等产品中的应用。
[0012]本专利技术提供一种纤连蛋白突变体及其应用，与现有技术相比优点在于：（1）本专利技术通过选取纤连蛋白与细胞增殖、迁移活性密切相关的结构域，构建纤连蛋白突变体D89，并对纤连蛋白突变体D89进行优化，有效提升优化后的纤连蛋白突变体D8的稳定性，同时便于后续的优化后的纤连蛋白突变体D8在核糖体上的翻译过程中的折叠，保证重组纤连蛋白D89的稳定制备。
[0013]（2）本专利技术制备的重组纤连蛋白D89具有良好的稳定性同时有效促进促进细胞增殖和迁移的活性，便于后续对相应药物开发，对本领域实验研究提供良好的导向。
附图说明
[0014]图1为D89重组纤连蛋白的表达电泳图；图2为D89重组纤连蛋白的温度优化电泳图；图3为D89重组纤连蛋白的IPTG诱导剂浓度的优化电泳图；图4中A为pet
‑
28a/D89工程菌摇瓶发酵生长曲线；B为pet
‑
28a/D89工程菌摇瓶发酵诱导时间选择电泳图；图5中A为目的蛋白D89Ni
‑
NTA分离纯化亲和层析图谱；B为目的蛋白D89Ni
‑
NTA分离纯化SDS
‑
PAGE电泳图；图6为不同浓度的D89重组纤连蛋白促细胞增殖率柱状分析图；图7为不同浓度的D89重组纤连蛋白促细胞粘附率柱状分析图；图8为不同浓度的D89重组纤连蛋白在不同时间对细胞迁移的显微镜照片；图9为不同浓度的D89重组纤连蛋白在不同时间对细胞迁移率的柱状分析图。
具体实施方式
[0015]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本专利技术实施例对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0016]实施例中涉及的主要材料：1、宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）（Merck）；2、质粒pET
‑
28a（Merck）；3、预染蛋白Marker（购自Fermentas公司）；4、Ni Sepharose 6 Fast Flow（购自GE公司）；
5、CCK
‑
8试剂盒（购自美国日本同仁公司）；6、其它试剂均为分析纯试剂：平衡缓冲液（1
×
PBS、pH7.4+20mmol/L咪唑），洗杂缓冲液（1
×
PBS、pH7.4+50mmol/L咪唑），洗脱缓冲液（1
×
PBS、pH7.4+300mmol/L咪唑）。
[0017]实施例1：选取纤连蛋白与细胞增殖、迁移活性密切相关的结构域，构建纤连蛋白突变体D89，其具体的核苷酸序列如下：ATGGCTGTTCCTCCTCCCACTGACCTGCGATTCACCAACATTGGTCCAGACACCATGCGTGTCACCTGGGCTCCACCC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纤连蛋白突变体，其特征在于，所述纤连蛋白突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO .1，且所述纤连蛋白突变体为选取纤连蛋白与细胞增殖、迁移活性密切相关的结构域，构建纤连蛋白突变体D89，并对纤连蛋白突变体D89的核苷酸进行两步优化来获得。2.根据权利要求1所述的一种纤连蛋白突变体，其特征在于：所述两步优化的方式为结合大肠杆菌密码子偏好性对纤连蛋白突变体D89的核苷酸序列进行初步优化，同时通过翻译暂停理论对纤连蛋白突变体的核苷酸序列做进一步的优化。3.一种如权利要求1
‑
2任意所述纤连蛋白突变体的应用，其特征在于：采用所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊盛，刘启伟，陈伟，廖佰鑫，余祥威，谢秋玲，李占鸿，
申请(专利权)人：广东暨大基因药物工程研究中心有限公司广州优理氏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：