一种嗜水气单胞菌的亚单位纳米疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种嗜水气单胞菌的亚单位纳米疫苗及其制备方法和应用，属于生物免疫领域。本发明专利技术选用阳离子脂质、疏水稳定剂及表面活性剂通过双乳化共同负载嗜水气单胞菌OMPP5重组蛋白抗原与免疫佐剂制备得到阳离子纳米疫苗。通过浸泡给药可以促进鱼鳃对该纳米疫苗的摄取，从而提高药物利用度。应用于大口黑鲈养殖显示出较强的免疫保护作用。该纳米疫苗制备方便，使用简单，其免疫效果稳定，保护率高。保护率高。保护率高。

【技术实现步骤摘要】
一种嗜水气单胞菌的亚单位纳米疫苗及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种嗜水气单胞菌的亚单位纳米疫苗及其制备方法和应用，属于生物免疫领域。

技术介绍

[0002]水产养殖满足了全球近一半的鱼类和贝类消费需求。水产养殖业的绿色健康发展是粮食安全的重要保障，与人类健康息息相关。病害是制约水产养殖发展的重要原因之一。已有研究表明，我国水产动物病害损失占鱼类总产量的15％。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是引发水生动物病害的重要病原微生物之一，广泛分布于各种水域环境中。受嗜水气单胞菌病害影响的鱼类主要包括大口黑鲈、鲤鱼和罗非鱼等。嗜水气单胞菌对宿主的定殖和感染受其结构成分、毒素和细胞外产物共同或单独影响，同时受到宿主免疫系统的影响。嗜水气单胞菌感染的鱼类疾病症状表现为败血症、赤鳍病和肠炎等。
[0003]近几十年来，疫苗在防控鱼类传染病中一直发挥着关键作用。在水产养殖中，它保护鱼类免受传染病的侵害，有效减少抗生素的使用，避免抗生素引发的细菌耐药性风险。目前，给鱼类接种疫苗的方法包括口服接种、浸泡接种和注射接种。其中，浸泡接种是将疫苗施加于鱼的表面，鱼体通过鳃、皮肤和侧线摄取抗原，刺激黏膜免疫诱发局部黏膜免疫应答，进而出现黏膜IgT和全身IgM的局部诱导和产生，从而达到免疫的效果，已被证明对预防多种鱼类病毒和细菌引发的疾病有效。施加浸泡疫苗的方式可以是将鱼短时间浸入浓缩疫苗溶液中，也可以是将疫苗溶液喷洒在鱼身上。浸泡接种适用于对幼小而无法进行高通量接种注射疫苗的鱼类进行大规模疫苗接种，对鱼类造成的压力最小。然而，浸泡疫苗的开发面临多个问题，致使其研究进展较为缓慢。首先，由于抗原在粘膜上的摄取效率低下，浸泡免疫需要大量的抗原蛋白；其次，抗原在水体中不稳定，易被分解，浸泡疫苗的效力不如腹腔注射的疫苗。已有研究表明，亚单位抗原具有生产方便，可通过发酵表达大批量制备，安全性更高的优点，可应用于浸泡疫苗的开发。目前，对嗜水气单胞菌亚单位抗原的研究主要集中在外膜蛋白(outer membrane proteins，OMP)上。OMP是暴露在细胞表面的表位，更容易与宿主免疫系统相互作用，是疫苗开发的良好候选者。OMP P5是嗜水气单胞菌的OMP之一，具有高免疫原性，能诱导机体产生较强的免疫应答，表现出较好的免疫保护效果。但是，亚单位抗原的免疫原性低，不稳定，需要配伍佐剂和有效的递送系统来增加其成药性。纳米递送技术共负载亚单位抗原和佐剂形成的纳米疫苗具有保护抗原不被水体中的酶降解，增强佐剂的成药性，促进抗原呈递细胞对其摄取及呈递的优势。

技术实现思路

[0004]本专利技术结合亚单位抗原、纳米递送技术和浸泡接种各自的特点，基于生物黏膜组织主要是由带负电的蛋白和其他生物大分子组成，通过制备带正电的纳米疫苗可促进鱼体对疫苗的摄取进而提高疫苗利用度这一原理，开发了一种嗜水气单胞菌亚单位纳米疫苗及其制备方法和应用。
[0005]在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所涉及的实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供相关术语的定义和解释。
[0006]如本文中使用的，术语“颗粒”是指在一定尺寸范围内具有特定形状的几何体，以离散颗粒、丸粒、珠粒或团粒存在为特征的物质状态，而不管其大小、形状或形态如何。
[0007]如本文中使用的，术语“纳米颗粒”是指尺寸(即颗粒的最长维度中的直径)小于100纳米的颗粒。
[0008]如本文中使用的，术语“粒径”即“等效粒径”，是指当被测颗粒的某种物理特性或物理行为与某一直径的同质球体(或组合)最相近时，就把该球体的直径(或组合)作为被测颗粒的等效粒径(或粒度分布)。
[0009]如本文中使用的，术语“平均粒径”是指对于一个由大小和形状不相同的粒子组成的实际粒子群，与一个由均一的球形粒子组成的假想粒子群相比，如果两者的粒径全长相同，则称此球形粒子的直径为实际粒子群的平均粒径。平均粒径的测量方法是本领域技术人员已知的，例如光散射法；平均粒径的测量仪器包括但不限于马尔文粒径仪。
[0010]如本文中使用的，术语“室温”是指25
±
5℃。
[0011]如本文中使用的，术语“免疫佐剂”是指同抗原一起或预先施用于机体内，能增强免疫原性或改变免疫反应类型的物质。免疫佐剂本身可以具有免疫原性，或不具有免疫原性。
[0012]如本文中使用的，术语“抗原”或“免疫原”是指能够诱导宿主体内的特异性免疫应答的物质。抗原可以包括整个生物体(例如灭活的、减毒的或活的生物体)；生物体的亚单位或部分；含有具有免疫原性的插入物的重组载体；在呈递给宿主后能够诱导免疫应答的DNA部分或片段；蛋白、糖蛋白、脂蛋白、多肽、肽、抗原表位、半抗原、毒素、抗毒素或其任何组合。
[0013]本专利技术选择生物相容性较好的阳离子脂质材料，PLGA和电中性表面活性剂DSPE
‑
PEG为改性材料，以重组蛋白OMP P5为抗原，以常见的分子佐剂为免疫激动剂，制备了三种适用于浸泡免疫的新型纳米疫苗，并通过统计浸泡免疫后大口黑鲈的相对存活率评价新型纳米疫苗的保护效果。数据表明OMP P5重组蛋白纳米疫苗可以作为预防大口黑鲈嗜水气单胞菌感染的候选疫苗。
[0014]本专利技术的目的在于克服现有鱼类亚单位疫苗存在的不足和缺陷，提供一种新型鱼用亚单位纳米疫苗。
[0015]本专利技术的另一目的在于提供所述新型纳米疫苗的制备方法。
[0016]本专利技术的再一目的在于提供所述的新型纳米疫苗的应用。
[0017]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0018]本专利技术提供一种纳米疫苗，包含OMP P5蛋白、免疫佐剂、阳离子聚合物、表面活性剂、疏水稳定剂。
[0019]在一种实施方式中，所述OMPP5蛋白的氨基酸序列为GenBankABK37458.1。
[0020]在一种实施方式中，所述免疫佐剂选自poly(I:C)、CpG、MPLA、角鲨烯一种或多种。
[0021]在一种实施方式中，所述免疫佐剂为CpG和/或MPLA。
[0022]OMP P5是暴露在细胞表面的抗原，可与宿主免疫系统相互作用，具有高免疫原性，
能诱导机体产生较强的免疫应答，从而产生较高的免疫保护效果。研究表明，OMP P5对大口黑鲈嗜水气单胞菌感染具有较好的预防效果。本专利技术通过静电作用由阳离子磷脂负载OMPP5蛋白和阴离子亲水佐剂，以疏水稳定剂稳定粒子。其中，疏水佐剂通过与疏水稳定剂同时加入而被负载，并利用表面活性剂进行修饰，形成含有OMP P5蛋白和特定免疫佐剂的纳米疫苗，相比于单独的OMPP5蛋白，本专利技术的纳米疫苗能够产生更优的免疫效果。
[0023]所述“包裹”并不限于将OMP P5蛋白和免疫佐剂完全置于纳米疫苗的内部。本专利技术的纳米疫苗中，OMP P5蛋白和免疫佐剂可以全部位于纳米疫苗内部，也可以部分位于纳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纳米疫苗，其特征在于，包含OMP P5蛋白、免疫佐剂、阳离子脂质、表面活性剂和疏水稳定剂；所述OMPP5蛋白的氨基酸序列为GenBankABK37458.1。2.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于，所述OMP P5蛋白：免疫佐剂：阳离子脂质：疏水稳定剂：表面活性剂的质量比为10～30:5～20:3～12:20～50:40～80。3.根据权利要求1或2所述的纳米疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂包括阴离子亲水佐剂和/或疏水佐剂。4.根据权利要求1～3任一所述的纳米疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂选自poly(I:C)、CpG、MPLA、角鲨烯中的一种或多种。5.根据权利要求1或2所述的纳米疫苗，其特征在于，所述阳离子聚合物选自溴化三甲基
‑
2,3
‑
二油酰氧基丙基铵、溴化三甲基
‑
2,3
‑
二油烯氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基
‑
2,3
‑
二油烯氧基丙基
‑2‑
(2
‑
精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化二甲基双十八烷基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、1，2
‑
二油酰
‑3‑
琥珀酰
‑
sn
‑
甘油胆碱酯、3β
‑
[N
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(N
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，N
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二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、硬脂胺中的一种或多种。6.根据权利要求1或2所述的纳米疫苗，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛健，陈肖丽，刘双平，
申请(专利权)人：江南大学绍兴产业技术研究院，
类型：发明
国别省市：