一种重组酪氨酸酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组酪氨酸酶突变体及其应用，属于生物工程领域。本发明专利技术通过分子生物学手段从巨大芽孢杆菌基因组中获得酪氨酸酶BM Tyr，将重组酪氨酸酶BM Tyr的第218位、第215位、第209位的氨基酸中的一个或多个进行突变得到重组酪氨酸酶突变体。本发明专利技术重组酪氨酸酶BM Tyr突变体氧化表儿茶素没食子酸酯活性，相对于重组酪氨酸酶BM Tyr提高了1.14～6.26倍，且重组酪氨酸酶BM Tyr突变体表现出较高的表儿茶素没食子酸酯活性。采用本发明专利技术的方法，提高了单位催化剂的生产能力和催化剂的反应效率，降低了反应的成本，加快了酶转化法生产茶黄素

【技术实现步骤摘要】
一种重组酪氨酸酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种重组酪氨酸酶突变体及其应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]茶黄素(Theaflavins，TFs)最早是在1957年由Roberts E.A.H从红茶中分离发现，是一类由多酚类物质氧化缩合而成的、能溶于乙酸乙酯呈橙黄色、并具有苯并卓酚酮结构的化合物的总称。目前已发现并进行结构鉴定的TFs有近30种，其中的主要成分有:茶黄素(theaflavin,TF)、茶黄素
‑3‑
单没食子酸酯(theaflavin
‑3‑
gallate,TF
‑3‑
G)、茶黄素
‑
3'
‑
单没食子酸酯(theaflavin
‑
3'
‑
gallate,TF
‑
3'
‑
G)和茶黄素
‑
3,3
’‑
双没食子酸酯(theaflavin
‑
3,3'
‑
gallate,TF
‑
3,3'
‑
G)等。红茶中的茶黄素含量一般为0.3％～1.5％,它们是红茶中的主要成分，对红茶的色香味及品质起着决定性的作用，能让红茶汤色“亮”，具有较强的滋味和鲜爽度，被誉为茶叶中的“软黄金”，且安全性高。茶黄素不仅是红茶的重要品质成分，还具有多种对人体健康有益的生理活性，如抗氧化、防癌抗癌、降血脂、预防心血管疾病、抗糖尿病、抗菌、抗病毒等，此外，茶黄素还是化妆品、食品的天然着色剂。因而受到国内外广泛关注，并成为研究热点。
[0003]目前，制备茶黄素的方法大致有三种:萃取法、化学氧化法﹑酶促氧化法。萃取法：由于茶黄素在红茶中含量低微，因而从红茶中直接提取、纯化茶黄素的难度大，且得率低；化学氧化法：需要使用大量的铁氰化钾、三氧化铁、氧化镁以及酸碱等化学试剂，环境污染严重，需要投入更多的污水处理费用，并且由于化学法缺乏底物专一性，副产品复杂，产品纯度、安全性受到限制；酶促氧化法反应条件温和、可控性强，能避免上述两种方法的弊端，体外酶促氧化是一种比较合适的方法。然而，在茶发酵过程中生成TFs，是通过细胞的多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)将儿茶素(Catechin)酶促氧化缩合而成。但自然生成酶量极低且受季节变化影响较大，因而直接从植物中规模化获取多酚氧化酶较困难。大量研究表明，通过蛋白质工程获取外源酶来工业化生产TFs，不但可以提高TFs的产量，而且能解决季节性限制的问题。
[0004]但是，在多酚氧化酶(漆酶、儿茶酚氧化酶和酪氨酸酶)中，酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)由于具有广泛的底物选择性而特别重要。酪氨酸酶可以广泛催化多酚类、氨基酚类、甲氧基酚类、芳香胺类、无机或有机金属化合物等的氧化。它们在结合分子氧时被激活，可以催化单酚酶反应周期或二酚酶反应周期。酶与外部的二酚分子(如L
‑
dopa)结合，并将其氧化为与水分子一起释放的邻醌，使酶处于中间过渡状态。然后酶结合第二个二酚分子，重复这个过程，最后以脱氧状态结束。通过酪氨酸酶体外酶促氧化制备茶黄素，对选中的母本酪氨酸酶进行蛋白质工程改造，提高区域选择性，优化转化条件，拟解决多酚氧化酶的来源和成本问题，提高茶黄素产量。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种重组酪氨酸酶BM Tyr突变体，所述重组酪氨酸酶BM Tyr突变体
的亲本酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006]所述重组酪氨酸酶BM Tyr突变体的亲本酶是来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)的酪氨酸酶BM Tyr。
[0007]本专利技术还提供了一种酪氨酸酶BM Tyr变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酶BM Tyr亲本酶的第218位、第215位、第209位的氨基酸中的一个或多个进行突变得到。
[0008]本专利技术所述的上述第218位、第215位、第209位的突变位点的编号，是按照重组酪氨酸酶BM Tyr的原始来源序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.1)进行编号的。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为以下(a)～(f)任一：
[0010](a)所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酶BM Tyr的第218位的缬氨酸突变为天冬酰胺得到的，突变体命名为V218N；
[0011](b)所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酶BM Tyr的第215位的甲硫氨酸突变为谷氨酸得到的，突变体命名为M215E；
[0012](c)所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酶BM Tyr的第209位的精氨酸突变为丝氨酸得到的，突变体命名为R209S；
[0013](d)所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酶BM Tyr的第218位的缬氨酸突变为天冬酰胺，同时将215位的甲硫氨酸突变为谷氨酸得到的，突变体命名为V218N/M215E；
[0014](e)所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酶BM Tyr的第218位的缬氨酸突变为天冬酰胺，同时将209位的精氨酸突变为丝氨酸得到的，突变体命名为V218N/R209S；
[0015](f)所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酶BM Tyr的第218位的缬氨酸突变为天冬酰胺，第215位的甲硫氨酸突变为谷氨酸，同时将209位的精氨酸突变为丝氨酸得到的，突变体命名为V218N/M215E/R209S。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组酪氨酸酶BM Tyr的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0017]本专利技术还提供了一种编码上述酪氨酸酶BM Tyr突变体的基因。
[0018]本专利技术还提供了携带上述基因的重组载体。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组载体以PET
‑
28a为表达载体。
[0020]本专利技术还提供了表达上述突变体，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞以Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主。
[0023]本专利技术还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了上述重组酪氨酸酶BM Tyr突变体。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主，以pET28a为表达载体。
[0025]本专利技术还提供了一种获得上述酪氨酸酶BM Tyr突变体的方法，所述方法包括以下<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组酪氨酸酶BM Tyr突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酶BM Tyr的第218位、第215位、第209位的氨基酸中的一个或多个进行突变得到。2.如权利要求1所述的重组酪氨酸酶BM Tyr突变体，其特征在于，所述突变体为以下(a)～(f)任一：(a)所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酶BM Tyr的第218位的缬氨酸突变为天冬酰胺得到的，突变体命名为V218N；(b)所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酶BM Tyr的第215位的甲硫氨酸突变为谷氨酸得到的，突变体命名为M215E；(c)所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酶BM Tyr的第209位的精氨酸突变为丝氨酸得到的，突变体命名为R209S；(d)所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酶BM Tyr的第218位的缬氨酸突变为天冬酰胺，同时将215位的甲硫氨酸突变为谷氨酸得到的，突变体命名为V218N/M215E；(e)所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酶BM Tyr的第218位的缬氨酸突变为天冬酰胺，同时将209位的精氨酸突变为丝氨酸得到的，突变体命名为V218N/R209S；(f)所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酶BM Tyr的第218位的缬氨酸突变为天冬酰胺，第215位的甲硫氨酸突变为谷氨酸，同时将209位的精氨酸突变为丝氨酸得到的，突变体命名为V218N/M215E/R209S。3.编码权利要求1或2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，黄盈，宋伟，刘佳，
申请(专利权)人：安徽科技学院，
类型：发明
国别省市：