一种藻蓝蛋白抗肿瘤肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术一种藻蓝蛋白抗肿瘤肽及其应用主要介绍了藻蓝蛋白酶解肽的制备和分离纯化的方法，并通过分子对接对分离得到的肽进行筛选，得到MQDAITAV肽，对MQDAITAV肽进行cck

【技术实现步骤摘要】
一种藻蓝蛋白抗肿瘤肽及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种筛选自藻蓝蛋白的多肽，及其制备方法和在抗肿瘤领域的应用。

技术介绍

[0002]肺癌是由于肺部恶性肿瘤引起的一种发病率和死亡率极高的癌症，其中非小细胞肺癌在肺癌总人群中占比达到85％以上。肺癌早期症状并不明显，常常容易与普通疾病混淆，因此确诊时已经进入晚期，导致治疗难度加大，对患者的生存质量造成严重影响。目前治疗非小细胞肺癌的方法虽然在不断进步，但其疗效并不理想。近年来，分子靶向治疗在癌症的治疗中受到了广泛关注并取得了一定发展，例如，奥希替尼、吉非替尼都作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂在临床上得到了应用并表现出良好的抗癌作用。然而，随着肿瘤耐药性的增强，药物使用的剂量也需要随之增加，大剂量的药物进入人体会导致体内正常细胞受到一定程度的损害，因此，研发出天然低毒高效的抗非小细胞肺癌药物具有很重要的价值。
[0003]海洋药物是天然药物的重要组成部分，海洋天然药物主要是针对癌症，心脑血管疾病等，近年来，我国已发现1300多种活性化合物，开发出多种新药及保健品。螺旋藻作为海洋生物之一，具有较高的营养价值和生物活性，被公认为是一种极好的食物，具有抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗癌等多种功能。螺旋藻具有丰富的蛋白质、碳水化合物、维生素、不饱和脂肪酸等，藻蓝蛋白是螺旋藻中的一种功能性蛋白质，在抗肿瘤、抗炎、抗氧化等方面都有明显作用，但多种自然因素都会影响藻蓝色素的稳定性使其降解失活。
[0004]生物活性肽是以蛋白质为原料，通过酸水解、碱水解、酶水解等方法得到的分子量小于6000Da的具有多种生物活性蛋白质水解物，生物活性肽可以直接参与调节机体生命活动具有一定的营养特性，从而成为研究热点之一。目前现有的生物活性肽大都来源于陆生动植物，对于海洋生物活性肽的研究较少。海洋生物由于生长环境的特殊性，相比于陆生生物具有独特的特点和优势，是一种开发新型生物活性肽的良好资源。因此，对于海洋生物活性肽的研究显得尤为必要。
[0005]抗癌肽可以通过抑制癌细胞生长增值迁移，破坏肿瘤细胞膜结构从而达到抗癌效果，而且几乎不会对人体正常细胞造成损伤。
[0006]分子对接主要是通过计算机辅助来筛选合适的药物，在运行过程中配体小分子(本文指多肽)会在受体结合位点处寻找最佳结合位点和最佳结合姿势，从而确定配体小分子和受体结合的最佳构象。常用分子对接软件主要有Autodock、Autodockvina、Discovery Studio等。对接步骤是先从蛋白数据库RCSB Protein Data Bank(https://www.rcsb.org)下载受体晶体结构，并对其进行加氢去水处理，对接后根据对接结果分析配体和受体相互作用。

技术实现思路

[0007]为克服现有技术存在的上述的缺陷，提供如下的技术方案：
[0008]本专利技术的第一个方面，提供一种制备对肿瘤有抑制活性的藻蓝蛋白多肽的方法，其特征在于，所述的多肽通过以下方法制备：
[0009]1)藻蓝蛋白的纯化：将藻蓝蛋白溶解后利用超滤管离心，去除杂蛋白和保护剂；
[0010]2)藻蓝蛋白酶解：将步骤1)纯化后的藻蓝蛋白利用胰蛋白酶水解；
[0011]3)超滤分离：将步骤2)获得的酶解产物利用三种不同截留分子量的超滤管超滤分离获得三种分子大小范围的产物；
[0012]4)对步骤3)获得的三种产物进行反向制备型液相色谱(RP
‑
HPLC)分离纯化。
[0013]在一个具体的实施例中所述的藻蓝多肽制备方法中，步骤1)使用的超滤管为截留分子量为10KD。
[0014]在另外一个具体的实施例中，所述的步骤2)的反应温度37～42℃，pH6.5～7.5，酶与底物比为(1～2)：(8～15)(g：g)，反应时间4～8h，酶解结束后沸水浴灭酶。
[0015]在另外一个具体的实施例中，步骤3)中的三种不同的截留分子量的超滤管分别为3KDa、5KDa和10KDa的超滤管。
[0016]在另外一个具体的实施例中，步骤4)中色谱柱为Agilent C18，检测波长220nm；流动相A：超纯水；流动相B：乙腈溶液。
[0017]在另外一个具体的实施例中，步骤4)的操作方法为：洗脱梯度：0
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6min，80％
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65％A(梯度洗脱)；6
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10min，65％
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45％A(梯度洗脱)；10
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15min，45％
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30％A(梯度洗脱),15
‑
20min，30％
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20％A。将溶好的样品(浓度：10mg/mL；上样量：10ml)通过0.22μm孔径的滤膜后注入RP
‑
HPLC装置分析，以5mL/min的流速梯度洗脱色谱柱，收集峰尖部分，收集并立即冻干，
‑
20℃储存备用。
[0018]本专利技术的第二个方面是提供本专利技术第一个方面所述的方法制备获得的对肿瘤具有抑制活性的藻蓝蛋白多肽组合物，其中所述的肿瘤为非小细胞肺癌。
[0019]本专利技术的第三个方面是提供一种对肿瘤具有抑制活性的多肽，其特征在于，所述的多肽氨基酸序列为MQDAITAV。在一个具体的实施例中，其特征在于，所述的肿瘤为非小细胞肺癌。
[0020]本专利技术的第四个方面是提供第二个方面或第三个方面所述多肽组合物或多肽在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
[0021]本专利技术的第五个方面是提供一种治疗非小细胞肺癌的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含本专利技术第三个方面所述的多肽组合物或本专利技术第四个方面所述的多肽；所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。
[0022]本专利技术的有益效果在于：
[0023]1)本专利技术一种藻蓝蛋白抗肿瘤肽及其应用主要介绍了藻蓝蛋白酶解肽的制备和分离纯化的方法，通过该方法获得了一种对于非小细胞肺癌具有抑制活性的多肽组合物；
[0024]2)并通过分子对接对分离得到的肽进行筛选，得到MQDAITAV肽，对MQDAITAV肽进行cck
‑
8试剂盒检测，细胞迁移实验，MQDAITAV肽对于非小细胞肺癌细胞具有良好的抑制作用。
附图说明
[0025]图1藻蓝蛋白纯化前后的对比：藻蓝蛋白经纯化后纯度明显提高，在紫外检测下藻
蓝蛋白在280nm和620nm处有特征吸收峰，因此其纯度可表示为A620/A280，纯化前藻蓝蛋白纯度为3.82，纯化后藻蓝蛋白纯度达到4.8，达到食品级。
[0026]图2分别比较了相同浓度下的藻蓝蛋白，以及用胰蛋白酶水解纯化前后的藻蓝蛋白对H460(A)、H1299(B)的存活率的影响，发现用胰蛋白酶水解纯化后的藻蓝蛋白对非小细胞肺癌细胞的存活有显著性影响。
[0027]图3分别比较了相同浓度下的藻蓝蛋白，以及用胰蛋白酶水解纯化前后的藻蓝蛋白对H460(A)、H本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备对肿瘤有抑制活性的藻蓝蛋白多肽的方法，其特征在于，所述的多肽通过以下方法制备：1)藻蓝蛋白的纯化：将藻蓝蛋白溶解后利用超滤管离心，去除杂蛋白和保护剂；2)藻蓝蛋白酶解：将步骤1)纯化后的藻蓝蛋白利用胰蛋白酶水解；3)超滤分离：将步骤2)获得的酶解产物利用三种不同截留分子量的超滤管超滤分离获得三种分子大小范围的产物；4)对步骤3)获得的三种产物进行反向制备型液相色谱(RP
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HPLC)分离纯化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的藻蓝多肽制备方法中，步骤1)使用的超滤管为截留分子量为10KD。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)的反应温度37～42℃，pH6.5～7.5，酶与底物比为(1～2)：(8～15)(g：g)，反应时间4～8h，酶解结束后沸水浴灭酶。4.根据权利要求1所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝帅，杨起，张文静，李前程，李凡念，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：