具有修复氧化损伤功能的C-藻蓝蛋白多肽及其制备方法技术

本发明专利技术涉及具有修复氧化损伤功能的C

【技术实现步骤摘要】
具有修复氧化损伤功能的C
‑
藻蓝蛋白多肽及其制备方法


[0001]本专利技术涉及功能多肽
，具体为具有修复氧化损伤功能的C
‑
藻蓝蛋白（C
‑
PC）多肽及其制备方法。

技术介绍

[0002]活性氧（ROS）是一类高活性的自由基或含氧分子，包括超氧自由基、羟基自由基和过氧化氢。在低浓度下，ROS对生物体是有益的，是新陈代谢中的信号分子。然而，当机体受到内源性或外源性因素的刺激时，ROS增加并引起氧化应激，从而导致生物损伤和各种疾病的发生。目前，市场中的合成抗氧化剂一般用于清除生物系统中的活性氧和自由基.虽然它具有很强的抗氧化活性，但有一定的副作用。
[0003]海洋占地球表面的70%左右，是地球生物圈中最丰富的组成部分之一，含有世界上80%以上的植物和动物物种。由于海洋环境极其广阔，与陆地动植物相比，其生物多样性和化学多样性异常丰富，因此海洋被认为是新型生物活性化分子来源的天然药物宝库。
[0004]螺旋藻（Spirulina）是一种蓝绿色的蓝藻，近些年来因其独特的医用价值而备受关注。螺旋藻中C
‑
PC的含量可高达60%，它是一种捕光色素蛋白，由α和β亚基组成。大量研究显示C
‑
PC具有许多潜在的生物学功能，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗过敏等活性。然而，C
‑
PC作为一种天然态的大分子量蛋白质，在人体肠道中难以吸收，且易凝结成块。一般来说，在人体消化过程中，大约三分之一的蛋白质以氨基酸的形式存在，三分之二被分解成肽。因此，许多研究人员将注意力转移到高纯度和小多肽的制备上。然而，到目前为止，关于C
‑
PC衍生的抗氧化肽的制备、鉴定和表征的报道还很少。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术的不足，提供一种具有修复氧化损伤功能的多肽及其制备方法与应用。
[0006]本专利技术技术方案如下：所述三个具有修复氧化损伤功能的多肽，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。SEQIDNO.1：P1：Met
‑
His
‑
Leu
‑
Trp
‑
Ala
‑
Ala
‑
Lys（MHLWAAK）；P2：Met
‑
Ala
‑
Gln
‑
Ala
‑
Ala
‑
Glu
‑
Tyr
‑
Tyr
‑
Arg（MAQAAEYYR）；P3：Met
‑
ASP
‑
Tyr
‑
Tyr
‑
Phe
‑
Glu
‑
Glu
‑
Arg（MDYYFEER）。
[0007]所述具有修复氧化损伤功能的C
‑
藻蓝蛋白（C
‑
PC）多肽的制备方法，步骤如下：S1.C
‑
PC酶解产物的制备称取1gC
‑
PC粉末溶解于60.64mL纯净水中，采用胰蛋白酶水解C
‑
PC，酶解的条件为：酶添加量55.18mg、温度49.4℃、pH8、时间120min，水解完毕后在95℃水浴锅中灭活酶15min；得到的水解物在4℃，12000r/min的条件下离心20min，收集上清液，用0.45μm再生纤维素滤膜过滤，旋蒸，浓缩得到C
‑
PC酶解产物（C
‑
PCH）；
S2.多肽混合原液制备将S1步骤中制得的C
‑
PCH通过Sephadex G
‑
100进行分离，将冻干的500 mg C
‑
PCH溶解在2 mL去离子水中，经0.45 μm微孔膜过滤并加载到 Sephadex 柱上（2.0x40 cm），洗脱液为去离子水，流速为0.5 mL/min，每20 min收集一份，根据薄层层析分析结果将馏分合并浓缩，制得多肽混合原液；S3.多肽活性段粗提物制备将S2步骤中制得的多肽混合原液用50% 甲醇
‑
水溶解，经0.45 μm微孔膜过滤，然后经Sephadex LH
‑
20进行分离，以50% 甲醇
‑
水为洗脱剂，按照0.25 mL/ min的速度收集样品，每40 min收集一份，将相同的活性段洗脱液合并，经浓缩，制得多肽活性段粗提物；S4.最终制备将S3步骤中制得的多肽活性段粗提物用超纯水溶解，配成10 mg/mL的溶液，经0.45 μm微孔膜过滤，滤液过制备型C
18 RP
‑
HPLC（ZORBAX, 300Extent
‑
C
18
）进一步分离纯化，流动相A为水，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，在六个柱体积内流动相B从1%
‑
100%，流速为0.8 mL/min，收集214 nm处主峰的洗脱液，经浓缩、干燥，制得具有修复氧化损伤功能的多肽。
[0008]优选的，所述根据S1步骤中，浓缩为在38
‑
40 ℃的条件下，旋转蒸发去除溶液中的水。
[0009]优选的，所述根据S2步骤中，真空减压浓缩条件为真空度为0.08
‑
0.1MPa，水浴温度为40
‑
45 ℃。
[0010]优选的，所述根据S2步骤中，采用体外抗氧化模型筛选活性多肽混合原液，具体步骤如下：采用DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力筛选出自由基清除率最高的馏分段。
[0011]优选的，所述根据S3步骤中，采用体外和体内抗氧化模型筛选多肽活性段粗提物，具体步骤如下：采用体外抗氧化模型和体内斑马鱼表皮细胞凋亡的氧化损伤模型筛选出抗氧化能力最强的馏分段。
[0012]优选的，所述根据S4步骤中，ZORBAX，300Extent
‑
C
18
柱规格为4.6mm
×
250mm,5μm。
[0013]优选的，所述根据S4步骤中，将主峰 Fraction C进行质谱鉴定。
[0014]优选的，所述根据S4步骤中，干燥条件为在
‑
20 ℃条件下冷冻干燥。
[0015]优选的，所述多肽作为药效成分在制备治疗氧化损伤性疾病药物中的应用；所述多肽作为保健成分在制备基于ROS的抗氧化保健品中的应用。
[0016]本专利技术提供了具有修复氧化损伤功能的C
‑
PC多肽及其制备方法。具备以下有益效果：1、本专利技术通过胰蛋白酶水解获得C
‑
藻蓝蛋白酶解物（C
‑
PCH）；通过Sephadex G
‑
100分离纯化得到五个组分（C
‑
PCH1, C
‑
PCH2, C
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有修复氧化损伤功能的C
‑
藻蓝蛋白（C
‑
PC）多肽，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的具有修复氧化损伤功能的C
‑
藻蓝蛋白（C
‑
PC）多肽的制备方法，其特征在于，步骤如下：S1.C
‑
PC酶解产物的制备称取1gC
‑
PC粉末溶解于60.64mL纯净水中，采用胰蛋白酶水解C
‑
PC，酶解的条件为：酶添加量55.18mg、温度49.4℃、pH8、时间120min，水解完毕后在95℃水浴锅中灭活酶15min；得到的水解物在4℃，12000r/min的条件下离心20min，收集上清液，用0.45μm再生纤维素滤膜过滤，旋蒸，浓缩得到C
‑
PC酶解产物（C
‑
PCH）；S2.多肽混合原液制备将S1步骤中制得的C
‑
PCH通过SephadexG
‑
100进行分离，将冻干的500mgC
‑
PCH溶解在2mL去离子水中，经0.45μm微孔膜过滤并加载到Sephadex柱上（2.0x40cm），洗脱液为去离子水，流速为0.5mL/min，每20min收集一份，根据薄层层析分析结果将馏分合并浓缩，制得多肽混合原液；S3.多肽活性段粗提物制备将S2步骤中制得的多肽混合原液用50%甲醇
‑
水溶解，经0.45μm微孔膜过滤，然后经SephadexLH
‑
20进行分离，以50%甲醇
‑
水为洗脱剂，按照0.25mL/min的速度收集样品，每40min收集一份，将相同的活性段洗脱液合并，经浓缩，制得多肽活性段粗提物；S4.最终制备将S3步骤中制得的多肽活性段粗提物用超纯水溶解，配成10mg/mL的溶液，经0.45μm微孔膜过滤，滤液过制备型C
18
RP
‑
HPLC（ZORBAX,300Extent
‑
C
18
）进一步分离纯化，流动相A为水，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，在六个柱体积内流动相B从1%
‑
100%，流速为0.8mL/min，收集214nm处主峰的洗脱液，经浓缩、干燥，制得具有修复氧化损伤功能的多肽。3.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：李冰，徐凤华，张姗姗，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：