确定配体与受体之间的相互作用的样品保持器组件制造技术

本公开涉及一种确定配体与受体之间的相互作用的样品保持器组件。受体可以是经固定的。本公开还涉及一种包括功能化的测试孔壁的样品保持器组件，其可以与全内反射荧光源组合使用。使用。使用。

【技术实现步骤摘要】
确定配体与受体之间的相互作用的样品保持器组件
[0001]本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/EP2019/070925，国际申请日为2019年08月02日，中国国家申请号为201980047443.7，进入中国国家阶段的进入日为2021年01月15日，专利技术名称为“确定配体与受体之间的相互作用的方法”。


[0002]本公开涉及一种确定第一配体(例如测试化合物)与受体(例如靶分子)之间的相互作用的方法。本公开还涉及一种用于所述方法的样品保持器组件。

技术介绍

[0003]在药物开发中使用生物传感器来产生结合动力学数据，在化合物优化过程中这些数据可用于进一步了解结构
‑
动力学关系。动力学信息通常通过基于微流体的生物传感器平台(例如表面等离振子共振(SPR))推导出，因为优化的流控技术和高采样速率允许准确描述分子结合和解离过程。关于扩展解离过程的信息最终可提供增强化合物功效和安全性的可能性，并因此在与相应的药代动力学特征相关联时可有助于确保治疗成功。
[0004]所有光学生物传感器平台都遵循相同的指导原则：将一个相互作用伴侣(通常是药物靶蛋白、寡核苷酸或甚至整个细胞)附着到生物传感器表面。随后用含有测试化合物的溶液挑战该经修饰的表面，以获得直接的结合信息，或研究在与细胞系统一起工作时结合的生物学后果。这种测定配置称为直接结合测定(DBA)。
[0005]表面等离子体共振(SPR)和光波导器(OWG)利用了倏逝波现象，因此能够测量与传感器表面的分子质量变化成比例的折射率变化。相反，生物层干涉测量法(BLI)通过分析干涉图样来工作，该干涉图样分析能够监视与传感器直接接触的层的有效光学厚度的变化。所有平台的共同点是能够对结合相互作用进行时间解析测量，尤其是在使用基于微流体的系统时。由于光学生物传感器系统不需要对所用试剂进行任何标记，因此它们通常被称为无标记技术，旨在减少可能因标记靶标或化合物而引入的测定伪像的数量。
[0006]基于微流体的生物传感器平台的一个共同特性是需要进行两个单独的实验。首先，使传感器表面与分析物接触。由此测量反应，反应的速率在最简单的情况下为结合速率常数k
on
和解离速率常数k
off
的卷积。通常，观察该反应直到达到传感器表面的平衡覆盖为止，其覆盖由平衡解离常数K
d
＝k
off
/k
on
确定。随后，使传感器表面暴露至无分析物的溶液，目的是监控仅解离反应，由此可以直接推导出k
off
。
[0007]这种类型的生物传感具有许多缺点，特别是当目标分子是膜蛋白时。据估计，所有获批的药物靶标中约60％是膜蛋白。特别是对于膜蛋白，成功率低至约30％。
[0008]许多药物靶标，尤其是膜蛋白，与传感器表面的固定不相容。因此，必须对靶标进行消耗大量时间和资源的修饰。
[0009]由于信号幅度与固定的靶标的数量成正比，因此它们需要表面上的高密度的药物靶标。
[0010]这些系统仅能够检测表面的净变化。因此，它们无法看到平衡时的结合和解结合
动力学。
[0011]这些传感器平台提供的传感器表面的数量非常有限。SPR系统通常具有3
‑
4个独立的传感器表面。这意味着如果靶标出现故障，则传感器会“丢失”。除了传感器的成本外，该设备无法记录该特定表面的任何其他数据。这极大地限制了通量。
[0012]在开始新的运行之前，传感器表面必须不含任何测试化合物。对于驻留时间长的化合物，这可能造成困难，并且表面再生往往限制了通量。
[0013]灵敏度受到生物传感器平台的技术特性的限制。
[0014]减轻靶标固定所带来的问题的一种方法是将药物靶标保持在溶液中。固定了所谓的工具化合物而不是固定靶标，而悬浮的靶标已知以特定方式与所述工具化合物相互作用。将测试化合物添加到仪器外的靶标上，以使靶分子和测试化合物分子反应，然后将所得溶液注入到经固定的工具化合物上方。该技术通常称为溶液抑制测定(ISA)。因此，通过研究不同浓度的测试化合物如何影响靶标与工具化合物的结合，可以确定测试化合物与药物靶标的平衡解离常数K
d
。J.Med.Chem.,(2013),56,3228
‑
3234公开了这种类型的测定。对于常规的无标签技术，经固定的工具化合物必须缓慢地与药物靶标解离。获得这样的工具化合物是困难的。
[0015]与DBA不同，无标记技术的配置无法与ISA组合来测量结合动力学，即结合速率常数k
on
和解离速率常数k
off
。Mol.Pharmacol.(1984),25,1
‑
9公开了非无标记技术允许通过竞争实验在非常有限的范围内测量动力学，并且还从数学上描述了在两种配体竞争与靶标的结合时结合动力学如何改变。如果一种配体(配体A)的动力学是已知的，并且该配体被标记为可以与另一种配体(配体B)区分开，则配体B的结合动力学可以通过记录配体A的结合动力学来确定。Anal.Biochem.(1975),468,42
‑
49公开了这些测定需要以高亲和力结合靶标的带标记的工具化合物。
[0016]Anal.Chem.(2015),87,4100
‑
4103公开了基于单分子的ISA(SMM
‑
ISA)，其允许以高灵敏度进行溶液抑制测定。对于该方法，靶标不固定在表面上，而是固定在悬浮的自由扩散的脂质体中/上，该脂质体在其脂质环境中携带有荧光染料。在表面上固定有能够结合靶标的工具化合物。用全内反射荧光(TIRF)显微镜使经修饰的表面成像。TIRF会产生激发光的倏逝场，该场只会激发接近表面(几百纳米)的脂质体。通过使脂质体的浓度保持较低，能够使与表面结合和从表面解离的单个脂质体成像。与上述常规方法相比，单分子测定法的高灵敏度使得工具化合物与药物靶标的亲和力低了几个数量级。另外，含靶标的脂质体的浓度可以比常规ISA中低几个数量级。
[0017]但是，在有关SMM
‑
ISA的第一份报告中，只能确定靶标与固定在表面上的工具化合物之间的结合动力学，而不能确定靶标与测试化合物之间的关键相互作用的动态动力学参数(结合速率常数k
on
和解离速率常数k
off
)。另一个缺点是通量低，必须进行大量的手动工作。这限制了成本效率、可重复性并因此限制了可靠性，因此不能满足工业要求。
[0018]Langmuir,2015,31(39),pp 10774
–
10780公开了使用全内反射荧光显微镜表征CXCR3(一种参与炎症反应的GPCR)及其两种趋化因子配体CXCL10和CXCL11之间的动力学。含GPCR的天然囊泡的脂质膜的荧光标记而非该膜蛋白本身的荧光标记，以及相应配体在表面的固定化，使得能够使用单分子平衡波动分析来确定溶液中受体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种配置成与TIRF显微镜检组合使用的样品保持器组件(100)，其包括：
‑
包括多个无底测试孔(2)的样品保持板(1)；
‑
底板(3)，所述底板(3)通过材料(4)连接至所述样品保持板(1)，从而形成所述多个测试孔(2)的孔底壁(5)，所述材料(4)的折射率(N
a
)低于所述底板(3)的折射率(N
g
)。2.如权利要求1所述的样品保持器组件(100)，其中，所述材料(4)是UV可固化的和/或耐缓冲溶液的。3.如权利要求2所述的样品保持器组件(100)，其中，所述材料(4)是UV可固化的和耐缓冲溶液的。4.如权利要求2所述的样品保持器组件(100)，其中，所述材料(4)是UV可固化的。5.如权利要求2所述的样品保持器组件(100)，其中，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：因辛古罗公司，
类型：发明
国别省市：