一种新型鸭源腺相关病毒实时荧光定量PCR检测的引物、探针及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种新型鸭源腺相关病毒(DAAV)实时荧光定量PCR检测的引物、探针及其试剂盒。所述引物与探针的序列如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种新型鸭源腺相关病毒实时荧光定量PCR检测的引物、探针及其试剂盒


[0001]本专利技术属于禽病学领域，具体涉及一种新型鸭源腺相关病毒(DAAV)实时荧光定量PCR检测的引物、探针及其试剂盒。

技术介绍

[0002]根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)的最新分类，细小病毒科(Family:Parvoviridae)下设三个病毒亚科(Sub Family)：Densovirinae(浓病毒亚科)、Hamaparvovirinae(中文名称待定)和Parvovirinae(细小病毒亚科)。Parvovirinae(细小病毒亚科)下设10个病毒属(genera)，其中腺相关病毒(Adeno
‑
associated virus，AAV)属于Parvovirinae(细小病毒亚科)下设的Genus:Dependoparvovirus(依赖性细小病毒属)。
[0003]腺相关病毒(Adeno
‑
associated virus，AAV)属于细小病毒亚科依赖性细小病毒属。AAV为无包膜，正二十面体，直径20～26nm，基因组大小为4.7kb的单链DNA。AAV本身为复制缺陷病毒，只有在辅助病毒(如腺病毒、疱疹病毒等)作用下才能复制增殖。它有两个大的开放阅读框(ORF)，末端重复序列(ITR)位于开放阅读框的两侧。左侧Rep编码的非结构性蛋白，对病毒的包装和复制起重要作用。右侧Cap编码的结构蛋白，负责病毒颗粒的整合、复制和装配。AAV不但能感染分裂细胞也能感染非分裂细胞，在体内具有广泛的组织嗜性。
[0004]目前AAV可分为三个基因群，大部分都从哺乳动物中检测到。研究还发现，已发现超过150余种病毒变异体。我们在开展水禽疫病流行病毒学调查时，在福建鸭群中发现存在新型鸭源腺相关病毒(duck adeno
‑
associated virus，DAAV)感染，对其(命名为DAAV
‑
FJ株)的Cap基因全长克隆发现，DAAV
‑
FJ株Cap基因全长为2217bp，和DAAV/G003
‑
20/Australia/2020(GenBank登录号为MW380871)核苷酸同源性为72.4％，氨基酸同源性为62.7％。
[0005]实时荧光定量PCR(real
‑
time fluorescent quantitative PCR，也见有简写为real
‑
time fluorescent PCR或real
‑
time PCR或qPCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标molecular Beacon。TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5
′
端标记有荧光报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC、JOE等，3
′
端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)，如Eclipse、TAMRA等。当探针完整的时候，5
′
端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3
′
端荧光基团淬灭，仪器检
测不到5
′
端报告基团所激发的荧光信号(就是说5
’
荧光基团的发射波长正好是3
’
荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3
’
荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5
′‑3′
外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5
′
端报告基团游离于反应体系中，远离3
′
端荧光淬灭基团的屏蔽，5
′
端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。目前，关于新型鸭源腺相关病毒(DAAV)致病性的研究较少，致病机理等相关研究还未见涉及。当前国内外尚未见实时荧光定量PCR检测新型鸭源腺相关病毒(DAAV)的引物组、探针及其方法相关研究报道，本专利技术的建立可填补国内外相关领域空白。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是填补现有尚未见实时荧光定量PCR检测新型鸭源腺相关病毒(DAAV)的方法相关研究报道的空白，提供一种新型鸭源腺相关病毒(DAAV)实时荧光定量PCR检测的引物和探针及其试剂盒。建立新型鸭源腺相关病毒(DAAV)实时荧光定量PCR检测方法，该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测29.1个拷贝，可用于对临床样本中新型鸭源腺相关病毒(DAAV)的分子流行病学调查，为明确新型鸭源腺相关病毒(DAAV)的分子流行病学特点提供检测方法和手段。
[0007]本专利技术的目的通过如下技术方案实现：
[0008]一种新型鸭源腺相关病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针，所述引物序列如下：
[0009]DAAV
‑
TqF：5
’‑
GTAACCTCGGTAAAGCGGTATT
‑3’
，
[0010]DAAV
‑
TqR：5
’‑
TTTCGACGTTCGTTGGTAGG
‑3’
；
[0011]所述探针序列DAAV
‑
TqP为：5
’‑
TTGGCTTGGCTGAAGACGGAAAGA
‑3’
，其5
’‑
端标记荧光报告基团FAM，3
’‑
端标记荧光淬灭基团DBQ1。
[0012]一种新型鸭源腺相关病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物和探针。
[0013]所述引物和探针用于新型鸭源腺相关病毒(DAAV)的实时荧光定量PCR检测方法为：
[0014](1)定量标准质粒的构建与制备
[0015]用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Viral DNA/RNA Kit按照说明书方法进行操作提取DAAV(F本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型鸭源腺相关病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于：所述引物序列如下：DAAV
‑
TqF：5
’‑
GTAACCTCGGTAAAGCGGTATT
‑3’
，DAAV
‑
TqR：5
’‑
TTTCGACGTTCGTTGGTAGG
‑3’
；所述探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：万春和，赵敏，付环茹，黄瑜，程龙飞，傅光华，陈红梅，刘荣昌，江南松，傅秋玲，施少华，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：