一种鉴定鬼针草属入侵种和本地种的特异性引物及方法和应用技术

本发明专利技术属于外来入侵物种鉴别领域，特别涉及一种鉴定鬼针草属入侵种和本地种的特异性引物及方法和应用，所述引物的序列为：正向引物：AGGAAACGCGAAATAGAACGGA；反向引物：ATTTGAGGGAGAAGGTCCCGT。本发明专利技术的方法通过稳定差异的DNA片段来开发了一种分子标记区分方法，仅通过简单的PCR和一代测序结果就能进行物种的鉴别和区分，成本低、操作简单、快速、准确，为检验检疫带来便利。为检验检疫带来便利。为检验检疫带来便利。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定鬼针草属入侵种和本地种的特异性引物及方法和应用


[0001]本专利技术属于外来入侵物种鉴别领域，特别涉及一种鉴定鬼针草属入侵种和本地种的特异性引物及方法和应用。

技术介绍

[0002]生物入侵已成为威胁全球生物多样性保护最主要的因素之一，随着我国全球贸易和旅游业的发展，我国幅员辽阔的疆土和复杂多样的自然环境为各类外来生物提供了优越的生存空间，已成为世界上遭受外来生物入侵最为严重的国家之一。
[0003]菊科植物是双子叶植物中物种数量最大的科之一，其入侵植物数量也是最多的类群之一，在我国外来入侵植物物种中，菊科占比约为20％。隶属于菊科的鬼针草属全球共有230多种，大部分分布于美洲。我国鬼针草属植物仅有十种，金盏银盘(B.biternata)、小花鬼针草(B.parviflora)等7个种为我国原产，其中大狼耙草(B.frondosa)原产于北美地区，是我国自然生态系统典型的外来入侵植物，也是被列入《中国自然生态系统外来入侵物种名单(第四批)》中的外来物种之一。该物种根系发达，吸收土壤水分和养分的能力很强，不仅影响本土植物的生长，甚至影响经济作物的产量。因此，在入侵物种的防控上对大狼杷草和鬼针草属本土物种的区分具有重要意义，尤其对出入境检验检疫。传统植物鉴定方法主要依靠形态学对比和观察鉴定，由于大狼杷草和鬼针草属本土物种金盏银盘等物种茎、叶和种子形态上非常难以区分，对鉴定技术力量要求较高，因此利用分子技术对两种物种进行区分对检验检疫以及防控治理有重要的现实意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对现有技术中存在的上述问题，利用二代测序技术对大狼耙草进行叶绿体全基因组测序，筛选出入侵种大狼耙草和本土种金盏银盘、小花鬼针草之间具有稳定差异的DNA片段，并以此为基础开发的分子标记区分方法，该方法能够准确、简单、快速地鉴别鬼针草属入侵种和本地种。
[0005]通过以下制备工艺来实现上述目的：
[0006]本专利技术提供了一种鉴定鬼针草属入侵种和本地种的特异性引物，所述引物的序列为：
[0007]正向引物：AGGAAACGCGAAATAGAACGGA；
[0008]反向引物：ATTTGAGGGAGAAGGTCCCGT。
[0009]本专利技术提供了一种鉴定鬼针草属入侵种和本地种的方法，利用上述特异性引物对待鉴定鬼针草属样本的DNA进行PCR扩增。
[0010]作为上述技术方案的进一步改进，包括以下步骤：
[0011]步骤S1、提取待鉴定鬼针草属样本的DNA；
[0012]步骤S2、以提取的所述DNA为模板，以所述正向引物和反向引物为特异性扩增引
物，进行PCR扩增；
[0013]步骤S3、将上述PCR扩增产物进行双向测序，并与Genbank上下载的金盏银盘和小花鬼针草序列进行对比，获得鉴定结果。
[0014]作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤S1中待鉴定鬼针草属样本的DNA为待鉴定鬼针草属干燥叶片的DNA。
[0015]作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤S2中PCR的扩增反应体系包括：总体积40μL，包括20μL 2
×
Taq PCR MasterMix，两种引物各1μL，20ng
×
μL
‑
1DNA模板1μL，去离子水17μL。
[0016]作为上述技术方案的进一步改进，所述步骤S2中PCR的扩增反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
[0017]作为上述技术方案的进一步改进，所述PCR扩增产物经1％琼脂糖电泳检测。
[0018]本专利技术还提供了一种上述特异性引物的获得方法，包括以下步骤：
[0019](1)对大狼耙草、金盏银盘和小花鬼针草三个物种取样后进行DNA提取，使用二代测序技术获得所述三个物种的叶绿体全基因组信息；
[0020](2)对所述叶绿体全基因组信息进行筛选，获得稳定区分大狼耙草和其他两个物种的DNA片段B62；
[0021](3)以所述DNA片段B62设计相应的B62的正反引物，即为所述特异性引物。
[0022]作为上述技术方案的进一步改进，所述DNA片段B62的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0023]本专利技术还提供了一种上述特异性引物在鉴定鬼针草属入侵种和本地种中的应用。
[0024]本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的方法对样品的要求比传统形态分类学鉴定方法要求低，传统形态分类学鉴定方法需要待检的大狼耙草或金盏银盘、小花鬼针草的全株，包括叶片、茎、花或果实，以确定其性状差异，完成鉴定(一般只能通过繁殖器官花的部分形态的显微观察来区分)。如果在检验检疫中，遇到只有营养器官叶片根茎、种子，则无法有效区分。而本专利技术的方法所需样品为待检植株上任何能获得DNA的部位，例如部分叶片或种子，并不要求植物的全株或某个器官完整，并且本专利技术的方法仅通过简单的PCR和一代测序结果就能进行两个物种的鉴别和区分、以及是否为大米草这一物种的鉴定，成本低、操作简单、快速、准确，为检验检疫带来便利。
附图说明
[0025]图1是本专利技术实施例中6个样品序列比对结果。
具体实施方式
[0026]下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请做出一些非本质的改进和调整。
[0027]1、材料
[0028]本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
[0029]2、方法
[0030]2.1引物设计
[0031]对大狼耙草、金盏银盘和小花鬼针草三个物种取样后进行DNA提取，使用二代测序技术获得三个物种的叶绿体全基因组信息；
[0032]对三个物种的叶绿体全基因组信息进行筛选，获得稳定区分大狼耙草和其他两个物种的DNA片段B62，序列如SEQ ID NO.1所示；
[0033]以DNA片段B62设计相应的B62的正反引物，具体如下表所示：
[0034]表1.引物序列表
[0035][0036]提取大狼耙草干燥叶片的总DNA；以该DNA为模板，依次加入引物1
‑
3进行PCR扩增。扩增反应体系为：总体积40μL，包括20μL 2
×
Taq PCR MasterMix，两种引物各1μL，20ng
×
μL
‑
1DNA模板1μL，去离子水17μL。扩增反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
[0037]PCR扩增产物经1％琼脂糖电泳检测，发现引物3不仅扩增效果最好，条本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定鬼针草属入侵种和本地种的特异性引物，其特征在于，所述引物的序列为：正向引物：AGGAAACGCGAAATAGAACGGA；反向引物：ATTTGAGGGAGAAGGTCCCGT。2.一种鉴定鬼针草属入侵种和本地种的方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的特异性引物对待鉴定鬼针草属样本的DNA进行PCR扩增。3.根据权利要求2所述的一种鉴定鬼针草属入侵种和本地种的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、提取待鉴定鬼针草属样本的DNA；步骤S2、以提取的所述DNA为模板，以所述正向引物和反向引物为特异性扩增引物，进行PCR扩增；步骤S3、将上述PCR扩增产物进行双向测序，并与Genbank上下载的金盏银盘和小花鬼针草序列进行对比，获得鉴定结果。4.根据权利要求3所述的一种鉴定鬼针草属入侵种和本地种的方法，其特征在于，所述步骤S1中待鉴定鬼针草属样本的DNA为待鉴定鬼针草属干燥叶片的DNA。5.根据权利要求3所述的一种鉴定鬼针草属入侵种和本地种的方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR的扩增反应体系包括：总体积40μL，包括20μL 2
×
Taq PCR MasterMix，两种...

【专利技术属性】
技术研发人员：李飞飞，赵彩云，朱金方，柳晓燕，
申请(专利权)人：中国环境科学研究院，
类型：发明
国别省市：