一种特异性鉴定嘉兴槜李种质的ISSR分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性鉴定嘉兴槜李种质的ISSR分子标记及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种ISSR分子标记引物，使用该引物可以简单方便地通过PCR方法来鉴别嘉兴槜李种质。所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述ISSR分子标记引物特征在于，序列为：5

【技术实现步骤摘要】
一种特异性鉴定嘉兴槜李种质的ISSR分子标记及其应用


[0001]本专利技术涉及一种特异性鉴定嘉兴槜李种质的ISSR分子标记及其应用，属于生物


技术介绍

[0002]槜李(Prunus salicina Lindl.)是蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus L.)植物，原产于浙江省嘉兴市，桐乡槜李于2011年获农产品地理标志保护登记。槜李果实熟透后果肉化成浆液，有酒香味，品质上乘，经济价值高。目前除浙江嘉兴的桐乡、海宁、海盐、湖州等地有槜李栽培外，在江苏、安徽等省也有少量引种。
[0003]槜李多采用嫁接繁殖，在不同栽培区域进行引种嫁接，极易造成同名异物及同物异名的现象。另外槜李受不同栽培管理方法、土壤及气候条件的影响，果实在成熟期的生物学特性及品质外观方面呈现一定的差异，市场上鱼目混珠给消费者带来极大困惑。
[0004]传统的植物分类方法是借助于对植物形态构造、生活习性等进行比较研究，随着科技的不断进步，植物分类方法逐步发展到分子生物学方法。由于槜李的果实外观受不同栽培管理方法、土壤及气候条件的影响，果实色泽往往不同，仅仅依靠果实形态来区分槜李与其他品种李难度较大，依靠传统的形态分类学方法在嘉兴槜李的鉴别上存在局限性。鉴于嘉兴槜李在地方特产及农业领域的重要地位，针对嘉兴槜李建立一套可靠的分子鉴定方法势在必行，对于嘉兴槜李的种质资源保护具有重要意义。
[0005]由于植物性状通常受环境因素和遗传基因的影响导致品种特性发生改变，仅靠形态特征较难区分开来，不利于种质资源保护及开发利用。分子标记技术不受环境条件和植物生长发育的影响，已被广泛用于植物种质资源的遗传多样性及亲缘关系分析，为分子辅助育种提供技术支持。ISSR是由Zietkiewicz等人于1994年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记，具有实验操作快速简单高效、遗传重复性好、多态性高等优点，二十余年来已广泛地应用于品种鉴定、系统发育、分子标记育种等方面。乔玉山及等人用ISSR分子标记对不同李品种进行了遗传多样性分析，指出ISSR标记是进行李种质资源鉴定和遗传多样性研究的有力工具。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种ISSR分子标记引物，使用该引物可以简单方便地通过PCR方法来鉴别嘉兴槜李种质。所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述ISSR分子标记引物特征在于，序列为：5
’‑
NAGAGAGAGAGAGAGAGYT
‑3’
，其中Y＝(C,T),N＝(A,G,C,T)。
[0007]本专利技术通过设计和筛选获得一个可以特异性鉴定嘉兴槜李种质的ISSR分子标记，该标记包含一条引物，利用该引物对李品种的基因组DNA进行PCR扩增，通过扩增产物大小的多态性即可鉴定嘉兴槜李种质。
[0008]本专利技术提供了一种ISSR分子标记引物在鉴定嘉兴槜李或在制备鉴定嘉兴槜李的产品中的应用，所述引物序列为：5
’‑
NAGAGAGAGAGAGAGAGYT
‑3’
，其中Y＝(C,T),N＝(A,G,C,
T)。
[0009]本专利技术还提供了一种用于嘉兴槜李的分子鉴定试剂盒，所述试剂盒含有上述ISSR分子标记引物，所述引物序列为：5
’‑
NAGAGAGAGAGAGAGAGYT
‑3’
，其中Y＝(C,T),N＝(A,G,C,T)。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述试剂盒中还含有PCR扩增所需试剂。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述PCR扩增的体系为：2.0μL 10
×
PCR缓冲液，0.5μLdNTP混合液，2.0μL ISSR分子标记引物，1.0μL样品DNA模板，0.2μL Taq DNA聚合酶，补dd H2O至20μL。
[0012]本专利技术还提供了一种鉴别嘉兴槜李种质的方法，所述方法为，提取待测样本的基因组DNA作为模板，用ISSR分子标记引物进行PCR扩增并检测，若出现一条大小为400bp的特异性条带，则待检测李样品为嘉兴槜李，所述引物序列为：5
’‑
NAGAGAGAGAGAGAGAGYT
‑3’
，其中Y＝(C,T),N＝(A,G,C,T)。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述PCR扩增的体系为：2.0μL 10
×
PCR缓冲液，0.5μLdNTP混合液，2.0μL ISSR分子标记引物，1.0μL样品DNA模板，0.2μL Taq DNA聚合酶，补dd H2O至20μL。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述PCR扩增条件为：
[0015]94℃预变性90s；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸5min。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述样品DNA模板的浓度为20ng/μL。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述ISSR分子标记引物的浓度为2.5μM。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，提取DNA时，可以采用李的叶片、茎、花等组织。对李DNA的提取方法也没有特殊要求，可以为CTAB法、SDS提取法、ROSE一管法、TPS提取法等，也可以直接采用商用试剂盒进行DNA的提取。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述PCR扩增的体系和条件影响鉴别的准确性。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，由于本专利技术在设计时，产生的特异性片段的大小为400bp左右，因此，可采用一般的琼脂糖凝胶进行电泳分析即可，琼脂糖的浓度可以为1.5％。
[0021]本专利技术还提供了上述试剂盒或上述方法在鉴定嘉兴槜李种质中的应用。
[0022]有益效果
[0023](1)本专利技术ISSR标记引物能够有效鉴别嘉兴槜李种质，且使用PCR的方法与传统的测序等方法相比，检测速度快、成本低、操作简单。
[0024](2)本专利技术的ISSR标记引物具有特异性好、稳定性好的优点，使用所述分子鉴定试剂盒和方法，可以实现对嘉兴槜李的快速鉴定，避免因居群间的多样性而导致假阳性的发生，适用于市场上及生产中对嘉兴槜李种质的快速鉴定。
附图说明
[0025]图1：嘉兴槜李果实照片。
[0026]图2：本专利技术的ISSR标记对嘉兴槜李及其他品种李的PCR扩增结果电泳图，其中，泳道2～26分别为：浙江嘉兴槜李(早熟)(P1)、浙江嘉兴槜李(中熟)(P2)、浙江嘉兴槜李(晚
熟)(P3)、浙江宁波茄皮李(P4)、浙江舟山金塘李(P5)、福建芙蓉李(P6)、湖北玉皇李(P7)、贵州九阡李(P8)、浙江桐乡黄姑李(P9)、安徽麦黄李(P10)、江西朱砂李(P11)、山东牛心李(P12)、黑龙江龙园秋李(P13)、日本大石早生(P14)、日本白李(P15)、日本秋姬(P16)、日本珍珠李(P17)、美国恐龙蛋(P18)、美国拉罗达(P19)、美国红心(P20)、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定嘉兴槜李的ISSR分子标记引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，其中Y＝(C,T),N＝(A,G,C,T)。2.权利要求1所述的ISSR分子标记引物在鉴定嘉兴槜李或在制备鉴定嘉兴槜李的产品中的应用。3.一种用于嘉兴槜李的分子鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的ISSR分子标记引物。4.如权利要求3所述的分子鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有PCR扩增所需试剂。5.一种鉴别嘉兴槜李种质的方法，其特征在于，所述方法为，提取待测样本的基因组DNA作为模板，用权利要求1所述ISSR分子标记引物进行PCR扩增并检测，若出现一条大小为400bp的特异性条带，则待检测李样品为嘉兴槜李。6.如权利要求5所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：李军，高广春，李白，刘洋，汪霞，
申请(专利权)人：嘉兴职业技术学院，
类型：发明
国别省市：