一种三重DARQ-LAMP等温扩增技术同时检测对虾病原体的方法技术

本发明专利技术公开了一种三重DARQ

【技术实现步骤摘要】
一种三重DARQ
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LAMP等温扩增技术同时检测对虾病原体的方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，尤其是涉及一种三重DARQ
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LAMP等温扩增技术同时检测对虾病原体的方法。

技术介绍

[0002]对虾养殖业作为重要的经济活动正在世界范围内迅速发展。然而，由病原体引发的疾病对整个行业造成了不可估量的经济损失。迄今为止，对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus)、传染性皮下和造血细胞坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus)和虾肝肠孢虫(Enterocytozoon hepatopancreatic)是在虾养殖中导致疾病的三种主要病原体。疾病的迅速传播，且无法早期做出快速诊断影响了对虾养殖业的快速发展。因此对虾中病原体快速准确的多重检测技术对水产行业具有重要意义。传统的聚合酶链式反应(PCR)虽已广泛应用于检测这三种病原体，但是PCR需要大型昂贵的温度循环仪器并且很费时。近年来随着技术的发展，环介导等温扩增技术(LAMP)被开发出来。LAMP技术用四到六组引物，使用具有高置换链活性的DNA聚合酶在等温条件下扩增目的基因，具有高灵敏度和高特异性。但是传统的LAMP检测方法不能同时检测多种靶标，因此本研究将基于探针的通过释放淬灭来检测扩增(DARQ)与环介导等温扩增相结合的DARQ
‑
LAMP技术，从而实现对虾中三种病原体的同时快速检测。
专利
技术实现思路

[0003]本专利技术为了克服现有技术的不足，提供一种三重DARQ
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LAMP等温扩增技术同时检测对虾病原体的方法。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：包括以下步骤：
[0005]S1、用消毒过的镊子从被感染对虾中取出肝胰脏组织；然后在研磨器中研磨均匀，操作置于冰上进行，待组织磨成匀浆后，即可放入冰箱中保存；
[0006]S2、使用商业试剂盒从50mg受感染的虾肝胰腺中提取总DNA；通过在紫外分光光度计上测量A260/A280的比例来确定提取的DNA的数量和质量。
[0007]S3、qPCR引物探针设计：与LAMP靶标基因相同，使用Primer premier软件设计引物和Taqman探针，探针标记FAM荧光基团；进行制备。
[0008]S4、优化三重DARQ
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LAMP，使用三种荧光标记的探针和不同的探针浓度。
[0009]S5、通过S2中制备的10倍浓度梯度的对虾白斑综合征病毒、传染性皮下和造血细胞坏死病毒、虾肝肠孢虫的基因组DNA进行灵敏度实验。每个浓度梯度取2.5μL当做模板加入到反应当中进行三重DARQ
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LAMP反应。
[0010]S6、通过使用基因组DNA试剂盒来提取实验病毒与菌株的基因组DNA；使用提取的DNA用于上述优化好的三重DARQ
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LAMP方法进行特异性实验。通过特异性分析评估DARQ
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LAMP方法学的准确性。
[0011]其中，S3中DARQ
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LAMP探针合成制备过程如下：
[0012]a、首先WSSV
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FIP(BHQ1)与WSSV
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FD(FAM)干粉放入离心机中，离心。
[0013]b、用TE缓冲液将FIP和FD溶解，用微量移液枪混匀；
[0014]c、将用微量移液枪混匀后的混合物放入金属恒温水浴锅中98℃，10分钟；
[0015]d、通过风冷装置将冷却腔内的冷却液从进水管吸入换液腔内；在换液腔内对冷却液进行冷却；再由出水管进入冷却腔内；在冷却的时候使冷却液开始流动；所述风冷装置包括设于换液腔内的第一偏心环、设于所述第一偏心环上的多个移动槽、设于所述移动槽上的移动板、设于所述移动板上的偏心板、设于所述第一偏心环上的风冷腔、设于所述移动槽内壁上的第一单向阀、设于所述冷却腔内壁上的第二单向阀；驱动第一偏心环开始在换液腔内偏心旋转；此时偏心板会沿换液腔内壁旋转移动；将冷却液从进水管吸入到换液腔内；同时偏心板会抵压移动板在移动槽内移动；此时将外界的空气吸入风冷腔内，对换液腔内的冷却液进行风冷；经过冷却的冷却液由出水管再次进入冷却腔内；冷却液驱动冷却环旋转，然后冷却环开始驱动冷却装置启动，将主体内的水吸入冷却盘内，通过冷却装置对水进行冷却，再排出；所述冷却装置包括设于所述冷却腔内壁上的旋转辊、设于所述旋转辊上的偏心块、设于所述偏心块上的第二偏心环、设于所述冷却盘侧壁上的两个开口、设于所述第二偏心环上的进水板、设于所述第二偏心环内的水冷腔、设于所述冷却盘上的联通管、设于所述第二偏心环内的水冷腔；冷却环旋转的时候带动旋转辊旋转，然后偏心块开始偏心旋转；带动第二偏心环在冷却盘内沿内壁偏心旋转移动；此时将主体内的水通过其中一个开口吸入冷却盘内；进一步的第二偏心环的移动会带动进水板上下移动，将冷却腔内的冷却液吸入水冷腔内；此时冷却液对冷却盘内的水进行冷却，然后经过冷却的水再由另一个开口排到主体内；直到水降温至室温，拿出混合物；
[0016]e、放置4℃冰箱保存代用。
[0017]本研方法兼顾LAMP反应的高特异性、高灵敏度特点，而且结合DARQ探针使反应进行多重具有了更多的可能；通过能加快冷却的金属恒温水浴锅能对探针制作提高了效率，进一步提高了检测的效果；通过冷却盘的设置实现了在冷却的时候，将热水吸入冷却盘中，然后通过冷却腔内的冷却液进行对水的冷却；再将冷却后的水再排入主体内；从而提高了水冷的效果；通过进水管和出水管的设置能将冷却腔内的冷却液吸入换液腔内，因此能对冷却液进行循环，有利于水冷的效果；通过换液腔的设置能在内部直接对冷却液进行冷却，从而提高了水冷效果；进一步加快了金属恒温水浴锅内水的降温，提高了检测的效率；通过偏心板的设置实现了随着第一偏心环的旋转改变换液腔的容积，因此能将冷却腔内的冷却液吸入换液腔内；然后再将冷却液从充日冷却腔内，实现冷却液的循环；通过移动板的设置能在移动的时候实现活塞运动，从而将外界的空气吸入移动槽内；通过外界的空气对冷却液进行冷却；因此能使冷却液降温，有利于对水的降温；进一步提高了检测的效率。
[0018]所述风冷装置还包括设于移动板上的移动弹簧、设于所述移动槽内壁上的第三单向阀、设于所述换液腔上的气压腔、设于所述第一偏心环上的第一旋转环、设于所述气压腔内的气压板、设于所述气压板底部的气压弹簧、设于所述第一旋转环上的第二旋转环、连接第一旋转环和第二旋转环的单向轴承、设于所述主体底部的搅动板、设于所述第二旋转环上的搅动机构；随着第一偏心环的旋转，会带动第一旋转环旋转；在单向轴承的作用下带动碟旋转环同步旋转；然后再搅动机构的作用下驱动搅动板在主体底部上下移动；随着移动
板的移动会将空气挤进气压腔内；然后驱动气压板向上移动；当气压板移动到气压腔的顶部的时候，驱动搅动机构将气压腔内的气体吹入水中。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三重DARQ
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LAMP等温扩增技术同时检测对虾病原体的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、用消毒过的镊子从被感染对虾中取出肝胰脏组织；然后在研磨器中研磨均匀，操作置于冰上进行，待组织磨成匀浆后，即可放入冰箱中保存；S2、使用商业试剂盒从50mg受感染的虾肝胰腺中提取总DNA；通过在紫外分光光度计上测量A260/A280的比例来确定提取的DNA的数量和质量；S3、qPCR引物探针设计：与LAMP靶标基因相同，使用Primer premier软件设计引物和Taqman探针，探针标记FAM荧光基团；进行制备；S4、优化三重DARQ
‑
LAMP，使用三种荧光标记的探针和不同的探针浓度；S5、通过S2中制备的10倍浓度梯度的对虾白斑综合征病毒、传染性皮下和造血细胞坏死病毒、虾肝肠孢虫的基因组DNA进行灵敏度实验。每个浓度梯度取2.5μL当做模板加入到反应当中进行三重DARQ
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LAMP反应；S6、通过使用基因组DNA试剂盒来提取实验病毒与菌株的基因组DNA；使用提取的DNA用于上述优化好的三重DARQ
‑
LAMP方法进行特异性实验；通过特异性分析评估DARQ
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LAMP方法学的准确性；其中，S3中DARQ
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LAMP探针合成制备过程如下：a、首先WSSV
‑
FIP(BHQ1)与WSSV
‑
FD(FAM)干粉放入离心机中，离心。b、用TE缓冲液将FIP和FD溶解，用微量移液枪混匀；c、将用微量移液枪混匀后的混合物放入金属恒温水浴锅中98℃，10分钟；d、通过风冷装置(2)将冷却腔(11)内的冷却液从进水管(10)吸入换液腔(12)内；在换液腔(12)内对冷却液进行冷却；再由出水管(13)进入冷却腔(1)内；在冷却的时候使冷却液开始流动；所述风冷装置(2)包括设于换液腔(12)内的第一偏心环(20)、设于所述第一偏心环(20)上的多个移动槽(21)、设于所述移动槽(21)上的移动板(22)、设于所述移动板(22)上的偏心板(23)、设于所述第一偏心环(20)上的风冷腔(24)、设于所述移动槽(21)内壁上的第一单向阀(25)、设于所述冷却腔(24)内壁上的第二单向阀(26)；驱动第一偏心环(20)开始在换液腔(12)内偏心旋转；此时偏心板(23)会沿换液腔(12)内壁旋转移动；将冷却液从进水管(10)吸入到换液腔(12)内；同时偏心板(23)会抵压移动板(22)在移动槽(21)内移动；此时将外界的空气吸入风冷腔(24)内，对换液腔(12)内的冷却液进行风冷；经过冷却的冷却液由出水管(13)再次进入冷却腔(11)内；冷却液驱动冷却环(14)旋转，然后冷却环(14)开始驱动冷却装置(4)启动，将主体(1)内的水吸入冷却盘(15)内，通过冷却装置(4)对水进行冷却，再排出；所述冷却装置(4)包括设于所述冷却腔(11)内壁上的旋转辊(40)、设于所述旋转辊(40)上的偏心块(41)、设于所述偏心块(41)上的第二偏心环(42)、设于所述冷却盘(15)侧壁上的两个开口(43)、设于所述第二偏心环(42)上的进水板(44)、设于所述第二偏心环(41)内的水冷腔(45)、设于所述冷却盘(15)上的联通管(46)、设于所述第二偏心环(42)内的水冷腔(47)；冷却环(14)旋转的时候带动旋转辊(40)旋转，然后偏心块(41)开始偏心旋转；带动第二偏心环(42)在冷却盘(15)内沿内壁偏心旋转移动；此时将主体(1)内的水通过其中一个开口(43)吸入冷却盘(15)内；进一步的第二偏心环(42)的移动会带动进水板(44)上下移动，将冷却腔(11)内的冷却液吸入水冷腔(47)内；此时冷却液对冷却盘(15)内的水进行冷却，然后经过冷却的水再由另一个开口(43)排到主体(1)内；直到水降温
至室温，拿出混合物；e、放置4℃冰箱保存代用。2.根据权利要求1所述的一种三重DARQ
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LAMP等温扩增技术同时检测对虾病原体的方法，其特征在于：所述S4中所使用的荧光标记是FAM，Cy5和VIC，可以在ABI7500Plus
TM
仪器中同时进行监测；探针的不同浓度为0.2μM，0.4μM，0.8μM，1.2μM。3.根据权利要求1所述的一种三重DARQ
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LAMP等温扩增技术同时检测对虾病原体的方法，其特征在于：所述风冷装置(2)还包括设于移动板(22)上的移动弹簧(27)、设于所述移动槽(21)内壁上的第三单向阀(28)、设于所述换液腔(12)上的气压腔(29)、设于所述第一偏心环(20)上的第一旋转环(201)、设于所述气压腔(29)内的气压板(202)、设于所述气压板(202)底部的气压弹簧(203)、设于所述第一旋转环(201)上的第二旋转环(204)、连接第一旋转环(201)和第二旋转环(204)的单向轴承(205)、设于所述主体(1)底部的搅动板(206)、设于所述第二旋转环(204)上的搅动机构(5)；随着第一偏心环(20)的旋转，会带动第一旋转环(202)旋转；在单向轴承(205)的作用下带动碟旋转环(204)同步旋转；然后再搅动机构(5)的作用下驱动搅动板(206)在主体(1)底部上下移动；随着移动板(22)的移动会将空气挤进气压腔(29...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明洲，付贤树，王倩，马骉，孙凯，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：