一种新型多靶点肝癌早期检测的标志物组合和试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种新型多靶点肝癌早期检测的标志物组合和试剂盒，通过从肝癌组织、癌旁组织、肝炎患者样本的高深度全基因组甲基化(WGBS)数据中找到了系列新型的、能高效区分肝癌和肝炎患者的甲基化位点，可用于早期肝癌的高效检测；将该新型基因甲基化位点与其他肝癌检测标志物(如AFP、AFP

【技术实现步骤摘要】
一种新型多靶点肝癌早期检测的标志物组合和试剂盒
[0001]本申请主张中国在先申请，申请号：202111439557.1，申请日2021年11月30日的优先权；其所 有的内容作为本专利技术的一部分。


[0002]本专利技术涉及癌症早期筛查领域，具体而言，涉及一种新型多靶点肝癌早期检测的标志物组合和试剂 盒。

技术介绍

[0003]肝癌长期生存率低的主要原因，首先在于肝癌早期诊断率低，导致70% ~ 80% 的患者在诊断时已经是中晚期，如果能够早期发现和早期诊断，可以施行肝切除术和肝移植等根治性手段，可明显改善肝癌患者预后。
[0004]目前而言，肝癌最主要的筛查手段是通过甲胎蛋白(AFP)进行检测，对于高风险人群再通过超声、 核磁等影像学手段进一步检查。对于可疑病灶时，用于确诊的金标准手段是肝穿刺活检。然而上述三种 检测手段都各有其局限性，根据文献报道，在检测特异性为95％时，甲胎蛋白(AFP)检测的灵敏度为 45％。超声检测灵敏度有限，同时也不能用于确诊。作为诊断金标准的肝穿刺活检则不仅有很大的侵入 性，且有引起肿瘤扩散的风险。不仅如此，由于肿瘤有普遍的肿瘤内异质性存在，导致很多时候肝穿刺 活检并不能显示肿瘤的全貌。
[0005]基于循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)检测的液体活检技术，由于其无创、实时、 灵敏的特点，使之成为癌症早筛的主要检测方法，其中ctDNA的甲基化指标凭借组织溯源、增强信噪 比、特征位点数量多等优势是癌症早筛的理想标志物。Kisiel等人(Hepatology,2019,69(3):1180
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1192) 一项针对95名肝细胞癌(HCC)患者和51名肝硬化对照的研究表明，甲基化DNA标记物组对小于2cm 的孤立性HCC的诊断灵敏度为75％。Cai等人(Gut,2019,68(12):2195
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2205)建立了一组由32个与HCC、 HBV或肝纤维化有关的基因组成的甲基化panel，他们利用加权模型和上述甲基化panel能够有效地将 HCC与慢性肝炎或肝硬化区分开来。在220名早期HCC与129名对照的验证队列研究中(Clinical CancerResearch,2019,25(17):5284
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5294)，诊断模型在区分早期HCC与HBV或肝硬化对照患者方面的灵敏度 为83％，特异性为67％。但是现有的甲基化位点的检测早期肝癌的AUC值普遍偏低，灵敏度和特异性 不高，并不能很好地区分肝癌和肝炎患者，依然还需要通过进一步地检查才能确诊。
[0006]另一方面，由于技术的局限性，ctDNA甲基化检测性能也有一定的天花板，结合基因组学、表观 遗传学、蛋白质组学等多组学指标已成为发展趋势。已有多个临床研究表明，多组学标志物检测的敏感 性和特异性优于单一组学标志物。2020年4月，Thrive联合了约翰霍普金斯大学、格伊辛格卫生医疗 系统，在Science杂志首次公布了Cancer SEEK的一项临床试验(DETECT
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A)研究的结果(Science,2020. 369(6499))。通过将血液筛查和PET
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CT筛查并用，研究人员能够将检测出的癌症患者数目翻倍，且筛 查阳性率能提高到99.6％。
2022年美国癌症早筛公司Exact Sciences在Clinical Gastroenterology andHepatology杂志公布了其肝癌早筛产品的最新研究成果(Clinical Gastroenterology and Hepatology 20.1 (2022):173
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182)。研究共计纳入540例患者的血液样本(136例病例+404例对照)，检测包含3种甲基 化标志物和1种蛋白标志物。结果显示整体检测灵敏度为88％，特异性为87％。
[0007]因此亟需找到能高效区分肝癌和肝炎的标志物组合，从而实现高灵敏度和高特异性的肝癌早期筛查， 促进肝癌的早发现和早治疗，满足临床的迫切需求。

技术实现思路

[0008]针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种新型多靶点肝癌早期检测的组合标志物和试剂盒及 其在肝癌早期检测中的应用。通过从肝癌组织、癌旁组织、肝炎患者样本的高深度全基因组甲基化 (WGBS)数据中找到了系列新型的、能高效区分肝癌和肝炎患者的甲基化位点，可用于早期肝癌的高 效检测；将该新型基因甲基化位点与其他肝癌检测标志物(如AFP、AFP
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L3、DCP)组合，能进一步 提高AUC值，提高早期肝癌筛查的灵敏度和特异性。
[0009]本研究小组曾申请肝癌早期检测的组合标志物的相关专利技术专利CN114592066A，但由于该专利在检 测时需要联合33个甲基化位点进行检测，检测过程较繁琐。为了优化甲基化标志物，本专利技术探索了相 关基因的大量全新的甲基化位点，找到了在肝癌和其他肝病患者中甲基化程度具有显著差异的全新的 18个甲基化位点，并从中找到了6个甲基化位点的组合，实现了在更少的标志物检测情况下对于早期 肝癌的高效检出，并且检出性能更高，甚至高于过去的33个甲基化位点组合的检测灵敏度和特异性。
[0010]一方面，本专利技术提供了一种标志物用于制备早期肝癌检测试剂的用途，所述标志物为选自如表1 所示的序列表Seq ID NO.1～Seq ID NO.18中的任意一种或多种所示的核苷酸序列或其完全互补序列的 组合：
[0011]表1、早期肝癌检测位点
[0012]序号靶序列1Seq ID NO.12Seq ID NO.23Seq ID NO.34Seq ID NO.45Seq ID NO.56Seq ID NO.67Seq ID NO.78Seq ID NO.89Seq ID NO.910Seq ID NO.1011Seq ID NO.1112Seq ID NO.1213Seq ID NO.13
14Seq ID NO.1415Seq ID NO.1516Seq ID NO.1617Seq ID NO.1718Seq ID NO.18
[0013]本专利技术通过对肝癌组织、配对的癌旁组织、肝炎患者血浆游离DNA进行高深度的全基因组甲基化 测序，同时综合大量公共数据(>1,000例肝癌和癌旁的450K芯片数据)，筛选出区分肝癌和非肝癌的 基于CpG的甲基化位点，然后进一步通过大量的肝癌和非肝癌血浆样本验证，最终发现并确定了在早 期肝癌患者中发生甲基化异常的9个基因以及18个靶序列。经临床验证，本专利技术提供的18个新型靶序 列，在肝癌和其他肝病患者中甲基化程度差异显著。
[0014]18个靶序列为双链DNA，存在互补序列，可以理解的是，本专利技术提供的甲基化位点靶序列可以是 其正义链，也可以是其反义链。
[0015]此外，虽然本专利技术所检测的基因与我司此前的专利技术专利CN 114592066 A中所检测的基因相同，但 是对应基因检测的区域完全不同。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种标志物用于制备早期肝癌检测试剂的用途，其特征在于，所述标志物为选自如序列表Seq ID NO.1～Seq ID NO.18中的任意一种或多种所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述标志物为包含如Seq ID NO.13或Seq ID NO.14所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述标志物为包括Seq ID NO.1和Seq ID NO.3所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.3和Seq ID NO.14所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.5和Seq ID NO.13所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合。4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述标志物为包括Seq ID NO.1、Seq ID NO.3、Seq ID NO.5、Seq ID NO.12、Seq ID NO.16和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.2、Seq ID NO.5、Seq ID NO.7、Seq ID NO.11、Seq ID NO.14和Seq ID NO.15所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.2、Seq ID NO.4、Seq ID NO.10、Seq ID NO.11、Seq ID NO.16和Seq ID NO.17所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.3、Seq ID NO.6、Seq ID NO.9、Seq ID NO.14、Seq ID NO.15和Seq ID NO.17所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.5、Seq ID NO.7、Seq ID NO.9、Seq ID NO.12、Seq ID NO.13和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括S...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琼，朱友杰，郑文渊，
申请(专利权)人：杭州翱锐基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：