可控生长工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种可控生长工程菌及其构建方法和应用，可控生长工程菌为在aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌基础上，进行dapA基因的敲除，构建了DAP营养缺陷型沙门氏菌突变体。其构建方法为：构建携带dapA基因上游和下游序列的重组自杀质粒pDM4

【技术实现步骤摘要】
可控生长工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤生物治疗
，尤其涉及可控生长工程菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]癌症是威胁人类健康的重大疾病之一，死于癌症的人数日益增加。随着生物医学的发展，癌症治疗方面已取得了突破性进展。目前肿瘤的主要治疗方式是手术、放疗及化疗的综合治疗，虽然在一定程度上可以缓解患者疼痛并使肿瘤体积缩小，但这些方法有着明显的局限性，包括肿瘤复发、药物耐受、以及机体毒副作用。近年来癌症研究人员研发出了一种新型癌症疗法即细菌介导的肿瘤疗法，用来解决目前临床上存在的问题。肿瘤微环境是肿瘤存在的细胞环境，很大程度上决定了肿瘤的生存和发展。肿瘤组织中不规则脉管系统导致的低氧、免疫抑制和营养丰富等独特的微环境使得兼性厌氧菌特异性地在此定居、繁殖，从而显示出细菌对肿瘤的高度靶向特异性。在细菌靶向定居肿瘤的过程中，细菌的病原相关分子模式，包括脂多糖、鞭毛蛋白、核酸等，会被机体的模式识别受体识别，通过激活相应的炎症信号通路，募集免疫细胞，引发强烈的炎症反应，并进一步激活机体的固有免疫反应与适应性免疫反应，从而杀死肿瘤细胞。
[0003]细菌介导的癌症治疗的一个关键优势是细菌在肿瘤中选择性积聚，细菌在肿瘤中浓度达到正常器官的一千倍，甚至一万倍以上。目前被广泛研究的细菌包括沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌等均有显著的抗肿瘤活性。其中，由于工程改造的减毒鼠伤寒沙门氏菌具有高度靶向多种实体瘤、肿瘤组织穿透能力强、广谱的抑癌效果和安全性等优势，而被广泛应用于抗癌研究。
[0004]但是，如果细菌在靶向肿瘤细胞的过程中过度增殖，可能会对正常组织产生杀伤能力，产生细菌治疗方面的安全性问题。另一方面，对于工程化的细菌在输送某些抗癌药物到达肿瘤部位的时候，如果细菌增殖过快，引起机体免疫反应的速度就会越快，此时对于评估该肿瘤治疗药物的效果会有很大影响。因此构建抗癌效果好和细菌增殖能力可控性的减毒菌株对提高细菌治疗肿瘤的安全性非常关键。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可控生长工程菌及其制备方法，可控生长工程菌在aroA突变或relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌基础上，将携带dapA基因上下游各1kb DNA片段的自杀质粒pDM4
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dapA
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U+D通过接合转移的方法转入至SL7207或ΔppGpp菌株中，进行dapA基因的敲除，构建了DAP营养缺陷型沙门氏菌突变体，该突变体感染机体后，无法在无DAP小分子的组织中增殖或持续存在，很快被机体清除。在该突变体靶向肿瘤后，通过瘤内注射DAP小分子，提高沙门氏菌L
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赖氨酸的生产能力，从而可以使得肿瘤部位的可控生长工程菌继续增殖，实现在细菌治疗肿瘤的过程中减毒工程菌的可控生长，提高肿瘤治疗的安全性。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种可控生长工程菌，所述可控生长工程菌为在鼠伤寒沙门氏菌基础上，进行dapA基因的敲除，构建了二氨基庚二酸(diaminopimelate，DAP)营养缺陷型沙门氏菌突变体。
[0007]上述的可控生长工程菌，进一步的，所述鼠伤寒沙门氏菌为aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌SL7207或relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌14028s/ΔppGpp。
[0008]具体为：在aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌SL7207或relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌14028s/ΔppGpp基础上，将携带dapA基因上下游各1kb DNA片段的自杀质粒pDM4
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dapA
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U+D通过接合转移的方法转入至SL7207或ΔppGpp菌株中，进行dapA基因的敲除，构建了DAP营养缺陷型沙门氏菌突变体SL7207/ΔdapA或DAP营养缺陷型沙门氏菌突变体ΔppGpp/ΔdapA，该突变体感染机体后，无法在无DAP小分子的组织中增殖或持续存在，很快被机体清除。在该突变体靶向肿瘤后，通过瘤内注射DAP小分子，可以使得SL7207/dapA或ΔppGpp/ΔdapA重新获得增殖能力，从而获得可控生长工程菌。
[0009]基于一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种上述的可控生长工程菌的构建方法，包括以下步骤：
[0010]S1、构建携带dapA基因上游和下游序列的重组自杀质粒pDM4
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dapA U+D；
[0011]S2、将所述重组自杀质粒pDM4
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dapA U+D导入至鼠伤寒沙门氏菌株中，通过两次同源重组，获得不能增殖的可控生长工程菌。
[0012]上述的构建方法，进一步的，还包括以下步骤：
[0013]S3、DAP小分子鉴定所述可控生长工程菌。
[0014]上述的构建方法，进一步的，所述S3具体包括以下步骤：
[0015]S3
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1、将所述可控生长工程菌在LB培养基中培养，细菌不生长；
[0016]S3
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2、通过外源加入DAP分子，恢复增殖能力的细菌则为dapA突变的鼠伤寒沙门氏菌。
[0017]上述的构建方法，进一步的，所述S1具体包括以下步骤：
[0018]S1
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1、根据aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌株SL7207基因组DNA设计两组引物：用于扩增包含dapA基因上游DNA片段的引物1和引物2；以及用于扩增包含dapA基因下游的DNA片段的引物3和引物4；
[0019]S1
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2、通过Crossover PCR的方法，利用引物1和引物4扩增dapA基因上游1kb和下游1kb相连片段，获得dapA基因上游和下游相连的扩增产物；
[0020]S1
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3、酶切所述dapA基因上游和下游相连的扩增产物和pDM4自杀质粒载体；
[0021]S1
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4、将酶切后的扩增产物连接到酶切后的pDM4自杀质粒上得到重组自杀质粒pDM4
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dapA U+D。
[0022]上述的构建方法，进一步的，所述S1具体包括以下步骤：
[0023]S1
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1、根据relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌14028s/ΔppGpp基因组DNA设计两组引物：用于扩增包含dapA基因上游DNA片段的引物1和引物2；以及用于扩增包含dapA基因下游的DNA片段的引物3和引物4；
[0024]S1
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2、通过Crossover PCR的方法，利用引物1和引物4扩增dapA基因上游1kb和下游1kb相连片段，获得dapA基因上游和下游相连的扩增产物；
[0025]S1
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3、酶切所述dapA基因上游和下游相连的扩增产物和pDM4自杀质粒载体；
[0026]S1
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4、将酶切后的扩增产物连接到酶切后的pDM4自杀质粒上得到重组自杀质粒pDM4
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可控生长工程菌，其特征在于，所述可控生长工程菌为在鼠伤寒沙门氏菌基础上，进行dapA基因的敲除，构建了DAP营养缺陷型沙门氏菌突变体。2.根据权利要求1所述的可控生长工程菌，其特征在于，所述鼠伤寒沙门氏菌为aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌SL7207或relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌14028s/ΔppGpp。3.一种权利要求1或2所述的可控生长工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、构建携带dapA基因上游和下游序列的重组自杀质粒pDM4
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dapA U+D；S2、将所述重组自杀质粒pDM4
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dapA U+D导入至鼠伤寒沙门氏菌株中，通过两次同源重组，获得不能增殖的可控生长工程菌。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：S3、DAP小分子鉴定所述可控生长工程菌。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述S3具体包括以下步骤：S3
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1、将所述可控生长工程菌在LB培养基中培养，细菌不生长；S3
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2、通过外源加入DAP分子，恢复增殖能力的细菌则为dapA突变的鼠伤寒沙门氏菌。6.根据权利要求3至5中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述S1具体包括以下步骤：S1
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1、根据aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌株SL7207基因组DNA或根据relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌14028s/ΔppGpp基因组DNA设计两组引物：用于扩增包含dapA基因上游DNA片段的引物1和引物2；以及用于扩增包含dapA基因下游的...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋健晖，郑金海，赵凌云，李也蔚，楚霞，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：