一种干细胞外泌体修复凝胶的制备方法和设备技术

本发明专利技术提供一种干细胞外泌体修复凝胶的制备方法和设备。本发明专利技术提供一种确保外泌体的活性以及稳定性的干细胞外泌体修复凝胶的制备方法和设备。一种干细胞外泌体修复凝胶的制备方法，包括有以下步骤：人脐带间充质干细胞的提取和培养、间充质干细胞外泌体的提取、间充质干细胞外泌体的鉴定检测和干细胞外泌体修复凝胶的制备等。本发明专利技术通过观测带间充质干细胞的密度以及鉴定检测间充质干细胞外泌体的活性，从而使得制备出的干细胞外泌体修复凝胶所含有的细胞因子具有一定的活性，并且通过壳聚糖修复凝胶作为干细胞外泌体与皮肤之间的载体，确保干细胞外泌体在皮肤愈合过程中的稳定性。稳定性。稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞外泌体修复凝胶的制备方法和设备


[0001]本专利技术涉及医药
，尤其涉及一种干细胞外泌体修复凝胶的制备方法和设备。

技术介绍

[0002]干细胞疗法是近几年来用于修复皮肤受损的新兴治疗方式，而间充质干细胞外泌体是负责细胞旁分泌作用的关键活性囊泡，间充质干细胞外泌体带有源细胞的细胞因子、生长因子、mRNA、脂质和蛋白质。
[0003]专利公开号为CN114515353A的专利公开了一种基于脐带干细胞和脐带干细胞外泌体的复合水凝胶、其制备方法及应用，所述的复合水凝胶包括脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料，其中所述的脐带干细胞、脐带干细胞外泌体和凝胶材料的体积比为1：1：2～4。上述专利技术所提供的复合水凝胶可缓慢释放脐带干细胞外泌体，延长外泌体在创伤表面的驻留时间，加快伤口的修复愈合，但是上述专利技术所提供的复合水凝胶不能确保外泌体的活性以及稳定性，因此无法确保长期释放外泌体的治疗效果。
[0004]鉴于上述技术问题，需要设计出一种确保外泌体的活性以及稳定性的干细胞外泌体修复凝胶的制备方法和设备。

技术实现思路

[0005]为了克服上述专利技术所提供的复合水凝胶不能确保外泌体的稳定性，因此无法确保长期释放外泌体的治疗效果，不便于加速创面再上皮化的缺点，本专利技术提供一种确保外泌体的活性以及稳定性的干细胞外泌体修复凝胶的制备方法和设备。
[0006]本专利技术的技术方案为：
[0007]一种干细胞外泌体修复凝胶的制备方法，包括有以下步骤：
[0008]S1、人脐带间充质干细胞的提取
[0009]取足月剖宫产的新生儿脐带，将其浸泡在磷酸盐缓冲液中3
‑
5分钟去除血水，取出新生儿脐带切成2
‑
3cm的片段，将新生儿脐带片段用磷酸盐缓冲液清洗干净，使用无菌手术刀剪掉其上的动脉和静脉，并且剪碎至0.5
‑
2mm，通过酶消化法提取分离人脐带间充质干细胞；
[0010]S2、人脐带间充质干细胞的培养
[0011]将步骤S1中获得的人脐带间充质干细胞加入至无血清培养基中，并且将无血清培养基置于35
‑
37℃，3％
‑
5％CO2的细胞培养箱内，每间隔24小时，用显微镜观测干细胞的密度；
[0012]S3、间充质干细胞外泌体的培养上清溶液的分离
[0013]取出步骤S2中培养一定时间后的无血清培养基，将其中的培养液取出经过三次离心后，利用0.20
‑
0.25um的滤膜过滤，使得细胞、死细胞及细胞碎片过滤出，得到含有间充质干细胞外泌体的培养上清溶液；
[0014]S4、间充质干细胞外囊泡的提取
[0015]取出步骤S3中含有间充质干细胞外泌体的培养上清溶液继续离心处理，离心温度调节至4
‑
6℃，以10000
‑
12000g的离心力离心，离心时间为30
‑
45分钟，弃去上清溶液，获得间充质干细胞外囊泡；
[0016]S5、间充质干细胞外泌体的提取
[0017]提取步骤S4中获得的细胞外囊泡用磷酸缓冲盐溶液重悬洗涤，再继续离心处理，在4
‑
6℃环境中，以18000
‑
20000g的离心力离心，离心时间为70
‑
75分钟，弃去上清溶液，即获得间充质干细胞外泌体；
[0018]S6、间充质干细胞外泌体的鉴定检测
[0019]提取步骤S5中获得的间充质干细胞外泌体，利用冷冻透射电镜观测间充质干细胞外泌体，若观测到的间充质干细胞外泌体为球型，并且直径在30
‑
100nm之间，则表示所制得的间充质干细胞外泌体符合要求，进入步骤S8，若观测到的间充质干细胞外泌体为破碎状，则表示所制得的间充质干细胞外泌体不符合要求，进入步骤S4，重新制取间充质干细胞外泌体；
[0020]S7、壳聚糖修复凝胶的制备
[0021]精密称取200
‑
300g壳聚糖粉末，溶解于乙酸溶液中，并进行磁力搅拌，在35
‑
37℃环境中，搅拌时间为4
‑
5h，以制备得到壳聚糖溶液；
[0022]将1000
‑
1500ml的β
‑
甘油磷酸钠水合物、500
‑
700ml的去离子水和200
‑
300g的NaHCO3粉末混合，通过涡旋、水浴超声溶解，并通过0.20
‑
0.25um的滤膜过滤，以制备得到含有NaHCO3的β
‑
甘油磷酸钠水合物溶液；
[0023]在0
‑
4℃环境中，将含有NaHCO3的β
‑
甘油磷酸钠水合物溶液滴加至壳聚糖溶液，磁力搅拌10
‑
15分钟，得到均匀的壳聚糖修复凝胶；
[0024]S8、干细胞外泌体修复凝胶的制备
[0025]将步骤S5中获得的间充质干细胞外泌体与步骤S7中获得的壳聚糖修复凝胶均匀混合，即得干细胞外泌体修复凝胶。
[0026]在其中一个实施例中，步骤S2中的无血清培养基中，滴加2
‑
3ml的氨甲环酸、粒细胞集落刺激因子和表皮生长因子，增加间充质干细胞的抗性。
[0027]在其中一个实施例中，步骤S3中三次离心的具体步骤包括有，
[0028]S3.1、第一次离心
[0029]在4
‑
6℃环境中，以300
‑
450g的离心力离心，离心时间为10
‑
12分钟，去除完整细胞；
[0030]S3.2、第二次离心
[0031]在4
‑
6℃环境中，以2000
‑
2100g的离心力离心，离心时间为10
‑
12分钟，去除细胞碎片；
[0032]S3.3、第三次离心
[0033]在4
‑
6℃环境中，以10000
‑
10500g的离心力离心，离心时间为30
‑
35分钟，去除死细胞。
[0034]在其中一个实施例中，步骤S7中的乙酸溶液浓度为350
‑
500mL、0.1mol/L。
[0035]在其中一个实施例中，步骤S7中的含有NaHCO3的β
‑
甘油磷酸钠水合物与壳聚糖溶
液比例为1：7～10。
[0036]在其中一个实施例中，步骤S8中的间充质干细胞外泌体与壳聚糖修复凝胶比例为1：3～5。
[0037]一种干细胞外泌体修复凝胶的制备设备，包括有搅拌框、安装架、第一离心机、磁力搅拌器、第二离心机、超声波恒温水浴器、温度传感器、过滤网板、连接管和阀门，搅拌框上部连接有安装架，安装架的左部下侧连接有第一离心机，安装架的左部上侧连接有第二离心机，第二离心机与第一离心机通过连接本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干细胞外泌体修复凝胶的制备方法，包括有以下步骤：S1、人脐带间充质干细胞的提取取足月剖宫产的新生儿脐带，将其浸泡在磷酸盐缓冲液中3
‑
5分钟去除血水，取出新生儿脐带切成2
‑
3cm的片段，将新生儿脐带片段用磷酸盐缓冲液清洗干净，使用无菌手术刀剪掉其上的动脉和静脉，并且剪碎至0.5
‑
2mm，通过酶消化法提取分离人脐带间充质干细胞；S2、人脐带间充质干细胞的培养将步骤S1中获得的人脐带间充质干细胞加入至无血清培养基中，并且将无血清培养基置于35
‑
37℃，3％
‑
5％CO2的细胞培养箱内，每间隔24小时，用显微镜观测干细胞的密度；S3、间充质干细胞外泌体的培养上清溶液的分离取出步骤S2中培养一定时间后的无血清培养基，将其中的培养液取出经过三次离心后，利用0.20
‑
0.25um的滤膜过滤，使得细胞、死细胞及细胞碎片过滤出，得到含有间充质干细胞外泌体的培养上清溶液；S4、间充质干细胞外囊泡的提取取出步骤S3中含有间充质干细胞外泌体的培养上清溶液继续离心处理，离心温度调节至4
‑
6℃，以10000
‑
12000g的离心力离心，离心时间为30
‑
45分钟，弃去上清溶液，获得间充质干细胞外囊泡；S5、间充质干细胞外泌体的提取提取步骤S4中获得的细胞外囊泡用磷酸缓冲盐溶液重悬洗涤，再继续离心处理，在4
‑
6℃环境中，以18000
‑
20000g的离心力离心，离心时间为70
‑
75分钟，弃去上清溶液，即获得间充质干细胞外泌体；S6、间充质干细胞外泌体的鉴定检测提取步骤S5中获得的间充质干细胞外泌体，利用冷冻透射电镜观测间充质干细胞外泌体，若观测到的间充质干细胞外泌体为球型，并且直径在30
‑
100nm之间，则表示所制得的间充质干细胞外泌体符合要求，进入步骤S8，若观测到的间充质干细胞外泌体为破碎状，则表示所制得的间充质干细胞外泌体不符合要求，进入步骤S4，重新制取间充质干细胞外泌体；S7、壳聚糖修复凝胶的制备精密称取200
‑
300g壳聚糖粉末，溶解于乙酸溶液中，并进行磁力搅拌，在35
‑
37℃环境中，搅拌时间为4
‑
5h，以制备得到壳聚糖溶液；将1000
‑
1500ml的β
‑
甘油磷酸钠水合物、500
‑
700ml的去离子水和200
‑
300g的NaHCO3粉末混合，通过涡旋、水浴超声溶解，并通过0.20
‑
0.25um的滤膜过滤，以制备得到含有NaHCO3的β
‑
甘油磷酸钠水合物溶液；在0
‑
4℃环境中，将含有NaHCO3的β
‑
甘油磷酸钠水合物溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张磊升，朱军辉，韩之海，
申请(专利权)人：福建汉氏联合干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：