本发明专利技术公开了一种矮姜花的组织培养方法，包括种子前处理、无菌苗与下胚轴愈伤组织诱导、愈伤增殖和转绿、丛生芽诱导和增殖、生根壮苗和移栽。本发明专利技术取矮姜花的果皮变黄尚未裂开的果，用刀片切去果蒂和果尾后消毒，将消毒好的果切开，取种子播在愈伤诱导培养基上培养，直至无菌苗的下胚轴形成白色愈伤组织创面；切掉无菌苗的下胚轴以上的部分、根和种子，将白色愈伤组织逐步转接到愈伤组织增殖和转绿培养基、丛生芽诱导和增殖培养基上诱导和增殖丛生芽；沿芽基部切下芽转移至壮苗生根培养基上培养30～40d，再在自然光照下炼苗12～15d，取出苗移栽，获得矮姜花的再生植株。本发明专利技术成本低，为矮姜花的组培快速繁殖和基因工程研究奠定基础，有利于矮姜花种苗的大规模生产应用。有利于矮姜花种苗的大规模生产应用。
【技术实现步骤摘要】
一种矮姜花的组织培养方法
[0001]本专利技术涉及植物组织培养方法，具体涉及一种矮姜花的组织培养方法。
技术介绍
[0002]矮姜花(Hedychium brevicaule D.Fang)属于姜科(Zingiberaceae)姜花属(Hedychium)植物，产我国广西，株高20～60cm，花期1～3月；苞片红褐色，花纯白色，花丝与唇瓣等长或稍长，花药长9mm；具浓郁兰花香、极矮生(胡秀，等2010；吴德邻，等2016)。矮姜花的根茎可用于咳嗽痰喘和支气管哮喘，也可盆栽观赏(吴德邻，等2016)。因此，矮姜花在药用和观赏方面具有很高的经济价值和市场开发利用前景。
[0003]矮姜花的繁殖方法主要依靠切分根茎和种子繁殖(胡秀，等2011)。由于矮姜花的分蘖数少，切分根茎的繁殖速度慢；种子从播种至开花需要两年至三年的时间，因此，这两种繁殖方法效率低，不能为其市场化应用提供足够的种苗，导致栽培规模扩大化的难度大。采用组织培养技术通过诱导愈伤组织获得再生植株，可为瓶苗的大规律繁殖提供一条有效途径。
[0004]姜花属植物的组织培养研究集中在白姜花(H.coronarium)(熊友华，等2005，2011；肖望，等2016；Hu，等2020)、红姜花(H.coccineum)(涂红艳，等2014；羡蕴兰，等1989)、金姜花(H.gardnerianum)(涂红艳，等2017)、H.muluense(Hamidou，等2008)和H.bousigonianum(Hamidou，等2009)。采用H.muluense茎尖生长点为外植体诱导愈伤组织，通过悬浮培养的方式对愈伤组织进行预培养，再对悬浮培养物进行体胚诱导；再用水杨酸和硝酸银对H.bousigonianum愈伤组织增殖和体胚诱导过程进行调控，对提高体胚发生的频率有一定作用(Hamidou，等2008，2009)。以白姜花的成熟种子萌发的无菌苗的下胚轴或不定芽为外植体，接种在MS+1mg/L 6
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BA+0.2mg/L NAA上培养时，通过诱导丛生芽繁殖并产生完整植株(熊友华，等2005，2011)；以白姜花的未成熟花丝为外植体，接种在MS+4mg/L 2,4
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D+4mg/L NAA+1mg/L 6
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BA的培养基上，经过180d的培养，诱导出愈伤组织(肖望，等2016)；以白姜花的假茎节段为外植体，接种在MS+3～5mg/L 6
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BA+2mg/L TDZ+0.01mg/L NAA的培养基上，诱导出类原球茎(Hu，等2020)。以红姜花的花序轴和苞片为外植体，接种在MS+1mg/L 6
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BA+2mg/L NAA的培养基上，通过诱导愈伤组织形成不定芽的方式获得再生植株(羡蕴兰，等1989)；以红姜花的花丝和花药为外植体，接种在MS+4mg/L 2,4
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D+4mg/L NAA+1mg/L 6
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BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂的培养基上，经过120d的培养，诱导出愈伤组织(涂红艳，等2014)。以金姜花的根状茎腋芽的0.5～2.0cm的芽顶端为外植体，接种在MS+5.0mg/L 6
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B+0.2mg/L NAA培养基上诱导出不定芽(涂红艳，等2017)。
[0005]本专利技术人在进行矮姜花的组织培养研究时发现，以矮姜花的假茎节段为外植体，接种在文献中使用的类原球茎培养基(Hu，等2020)：MS+5mg/L 6
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BA+2mg/L TDZ+0.01mg/L NAA上培养时，假茎节段无萌动；以矮姜花的花序轴为外植体，接种在文献中使用的愈伤组织诱导培养基(羡蕴兰，等1989)：MS+1mg/L 6
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BA+2mg/L NAA上培养时，花序轴无愈伤组织出现；以矮姜花的无菌苗的不定芽为外植体，接种在文献中使用的丛生芽增殖培养基(熊友
华，等2005，2011)：MS+1mg/L 6
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BA+0.2mg/L NAA上培养时，出现了芽生长缓慢的现象，说明文献所列的培养基配方不适合矮姜花的组织培养。此外，文献只报道了白姜花、红姜花、H.muluense和H.bousigonianum的愈伤组织通过体胚诱导途径进行再生植株的过程(肖望，等2016；涂红艳，等2014；Hamidou，等2008，2009)，目前，仍缺乏矮姜花直接通过愈伤再生植株的组织培养技术报道。因此，需要专利技术一种矮姜花的组织培养方法来解决上述问题。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于提供以矮姜花无菌苗的下胚轴诱导愈伤及其植株再生的组织培养方法。本专利技术可为矮姜花的种苗规模化离体繁殖提供有效的组织培养体系。
[0007]本专利技术包括如下步骤：
[0008](1)种子前处理：取矮姜花的果皮变黄尚未裂开的果，置入超净工作台，用刀片切去果蒂和果尾后，再用无菌棉球蘸取酒精溶液擦拭果表面，然后用升汞溶液消毒，再置入无菌水中清洗，取出放入无菌碟子中晾干果表面的水分，获得矮姜花的灭菌果。
[0009](2)无菌苗与下胚轴愈伤组织创面诱导：在超净工作台上，将步骤(1)获得的矮姜花的灭菌果用刀片沿着果棱切开，取鲜红的种子播在愈伤组织诱导培养基上，经过115～135d培养，直至萌发的无菌苗的下胚轴分化形成愈伤组织创面；所述的无菌苗与下胚轴愈伤组织诱导培养基为：MS+6
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苄氨基腺嘌呤6.0～9.0mg/L+噻苯隆6.0～8.0mg/L+奈乙酸0.03～0.05mg/L+椰汁25.0～30.0％+蔗糖35～40g/L+卡拉胶粉13.0～13.5g/L，pH6.2～6.4。
[0010](3)愈伤组织增殖和转绿：在超净工作台上，将步骤(2)获得的无菌苗的下胚轴分化形成的白色愈伤组织，用刀片切掉无菌苗的下胚轴以上的部分、根和种子，保留白色愈伤组织，转接到愈伤增殖和转绿培养基上，经过60～90d培养，愈伤组织的体积明显增大且转绿；所述的愈伤组织增殖和转绿培养基为：MS+6
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苄氨基腺嘌呤5.0～6.0mg/L+噻苯隆0.5～0.6mg/L+奈乙酸0.03～0.05mg/L+香蕉汁20.0～30.0％+蔗糖35～40g/L+卡拉胶粉13.0～13.5g/L，pH6.2～6.4。
[0011](4)丛生芽诱导培养：在超净工作台上，将步骤(3)转绿的愈伤组织，转接到初代丛生芽诱导培养基中诱导丛生芽，经过35～45d培养，获得丛生芽团块；所述丛生芽诱导培养基为：MS+6
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苄氨基腺嘌呤5.0～6.0mg/L+噻苯隆0.5～0.6mg/L+奈乙酸0.01～0.03mg/L+香蕉汁20.0～30.0％+蔗糖35～40g/L+卡拉胶粉13.0～13.5g/L，pH6.2～6.4。
[0012](5)丛生芽增殖培养：在超净工作台上，将步骤(4)诱导的丛生芽团块，用刀片切割成小团块，每个小团块含有丛生芽4～6个，再将每个小团块上的丛生芽的叶片和茎尖切本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种矮姜花的组织培养方法，其特征在于包括以下步骤：(1)种子前处理：取矮姜花的果皮变黄尚未裂开的果，置入超净工作台，用刀片切去果蒂和果尾后，再用无菌棉球蘸取酒精溶液擦拭果表面，然后用升汞溶液消毒，再置入无菌水中清洗，取出放入无菌碟子中晾干果表面的水分，获得矮姜花的灭菌果。(2)无菌苗与下胚轴愈伤组织创面诱导：在超净工作台上，将步骤(1)获得的矮姜花的灭菌果用刀片沿着果棱切开，取鲜红的种子播在愈伤组织诱导培养基上，经过115～135d培养，直至萌发的无菌苗的下胚轴分化形成愈伤组织创面；所述的无菌苗与下胚轴愈伤组织诱导培养基为：MS+6
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苄氨基腺嘌呤6.0～9.0mg/L+噻苯隆6.0～8.0mg/L+奈乙酸0.03～0.05mg/L+椰汁25.0～30.0％+蔗糖35～40g/L+卡拉胶粉13.0～13.5g/L，pH6.2～6.4。(3)愈伤组织增殖和转绿：在超净工作台上，将步骤(2)获得的无菌苗的下胚轴分化形成的白色愈伤组织，用刀片切掉无菌苗的下胚轴以上的部分、根和种子，保留白色愈伤组织，转接到愈伤增殖和转绿培养基上，经过60～90d培养，愈伤组织的体积明显增大且转绿；所述的愈伤组织增殖和转绿培养基为：MS+6
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苄氨基腺嘌呤5.0～6.0mg/L+噻苯隆0.5～0.6mg/L+奈乙酸0.03～0.05mg/L+香蕉汁20.0～30.0％+蔗糖35～40g/L+卡拉胶粉13.0～13.5g/L，pH6.2～6.4。(4)丛生芽诱导培养：在超净工作台上，将步骤(3)转绿的愈伤组织，转接到初代丛生芽诱导培养基中诱导丛生芽，经过35～45d培养，获得丛生芽团块；所述丛生芽诱导培养基为：MS+6
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苄氨基腺嘌呤5.0～6.0mg/L+噻苯隆0.5～0.6mg/L+奈乙酸0.01～0.03mg/L+香蕉汁20.0～30.0％+蔗糖35～40g/L+卡拉胶粉13.0～13.5g/L，pH6.2～6.4。(5)丛生芽增殖培养：在超净工作台上，将步骤(4)诱导的丛生芽团块，用刀片切割成小团块，每个小团块含有丛生芽4～6个，再将每个小团块上的丛生芽的叶片和茎尖切掉，保留团块基部，接种丛生芽增殖培养基，经过30～40d培养，获得增殖的丛生芽；所述丛生芽增...
【专利技术属性】
技术研发人员：李冬梅，朱根发，刘海林，于波，黄丹，
申请(专利权)人：广东省农业科学院环境园艺研究所，
类型：发明
国别省市：
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