具有经修饰重链恒定区的多特异性重链抗体制造技术

提供多特异性人类重链抗体(例如UniAbs

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有经修饰重链恒定区的多特异性重链抗体
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年4月29日提交的美国临时专利申请序列号63/017,589以及于2020年11月2日提交的美国临时专利申请序列号63/108,796的申请日的优先权权益，这些申请的全部公开内容通过引用并入本文。


[0003]本专利技术涉及多特异性人类重链抗体(例如UniAbs
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)，其具有赋予有利性质的经修饰重链恒定区。本专利技术进一步涉及制造此类抗体的方法、包含此类抗体的组合物，包括药物组合物，以及它们治疗特征在于一种或多种本文所述的结合靶的表达的病症的用途。

技术介绍

[0004]经修饰Fc区
[0005]蛋白质工程的进展已引起对两个或更多个靶具有结合亲和力的多特异性抗体的成功制造和临床使用。然而，由于其异二聚体性质，必须利用适当措施来促进多特异性抗体中期望结合序列组合的正确配对，并且因此促进多肽亚基的正确配对。Wang等人，mAbs 10:8,1226
‑
1235(2018)。
[0006]规避错配多肽亚基问题的一种方法称为“旋钮入孔(knobs
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into
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holes)”(KiH)，并且其旨在通过在CH2和/或CH3结构域中引入突变来修饰接触界面迫使两条不同的抗体重链配对。在一条链上，粗大的氨基酸经具有短侧链的氨基酸替代以产生“孔”。相反，具有大侧链的氨基酸引入另一重链中以产生“旋钮”。通过共表达该两条重链，观察到异二聚体形成(“旋钮
‑
孔”)的产率高于同二聚体形成(“孔
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孔”或“旋钮
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旋钮”)，此归因于旋钮
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孔对更有利的稳定性(Ridgway,J.B.等人，Protein Eng.9(1996)617
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621；以及WO 96/027011)。
[0007]尽管这种策略对于实现期望异二聚体似乎有吸引力，但所得多特异性抗体的其它性质高度依赖于Fc区的特定氨基酸序列，即效应功能，例如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。另外，效应功能活性可诱导细胞因子的产生，此可导致不期望炎症反应的“细胞因子风暴”。Gupta等人，Journal of Interferon&Cytokine Research 40:1,19
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23(2019)。因此，在某些情况下，需要降低或完全消除效应功能，例如以避免损害或杀伤多特异性抗体结合的免疫细胞(例如T细胞)，和/或避免不期望的细胞因子产生和所导致的不期望的炎症反应。
[0008]另外，将氨基酸修饰引入蛋白质中可具有严重缺点，即基于非天然序列的存在，诱导患者对所述蛋白质的免疫反应。因此，多特异性抗体的开发需要鉴别以下序列：与天然抗体(如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的一般结构非常相似并且与天然序列的偏差最小，但成功地纳入可同时实现促进期望异二聚化、同时还实现一种或多种效应功能的降低或消除的目标的修饰。
[0009]为平衡这些竞争性需求，本专利技术者关注IgG4 Fc，已知其天然序列具有相对较低水平的效应功能活性。Crescioli等人，Curr Allergy Asthma Rep 16:7(2016)。然而，尽管
IgG4看似具有这个优点，但由于其特定铰链区序列，已知其会发生活体内链交换反应，此呈现实现期望异二聚化的额外复杂性。Labrijn等人，Nature Biotechnology 27,767
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71(2009)。因此，需要经修饰的重链恒定区序列来实现期望异二聚化，纳入降低或消除效应功能的修饰，同时纳入降低或消除IgG4中的链交换反应的修饰。本文所述的分子解决了这些和其它挑战。
[0010]重链抗体
[0011]在常规IgG抗体中，重链和轻链的缔合部分归因于轻链恒定区与重链CH1恒定结构域之间的疏水相互作用。在重链框架区2(FR2)和框架区4(FR4)中存在还有助于重链与轻链之间的这种疏水相互作用的额外残基。
[0012]然而，已知骆驼科(骆驼亚目，其包括骆驼、单峰骆驼和骆马)的血清含有一大类仅由成对H链构成的抗体(仅重链抗体或UniAbs
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)。骆驼科(单峰骆驼(Camelus dromedarius)、双峰骆驼(Camelus bactrianus)、大羊驼(Lama glama)、原驼(Lama guanaco)、羊驼(Lama alpaca)和瘦驼(Lama vicugna))的UniAbs
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具有由单一可变结构域(VHH)、铰链区和两个恒定结构域(CH2和CH3)组成的独特结构，所述两个恒定结构域与经典抗体的CH2和CH3结构域高度同源。这些UniAbs
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缺少恒定区的第一结构域(CH1)，其存在于基因组中，但在mRNA加工期间被剪接出来。CH1结构域的缺失解释了UniAbs
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中轻链的缺失，这是因为该结构域是轻链恒定结构域的锚定位置。此类UniAbs
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天然进化以赋予常规抗体或其片段的三个CDR的抗原结合特异性和高亲和力(Muyldermans,2001；J Biotechnol 74:277
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302；Revets等人，2005；Expert Opin Biol Ther 5:111
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124)。软骨鱼(例如鲨鱼)还已进化出不同类型的免疫球蛋白，称为IgNAR，其缺少轻多肽链并且完全由重链构成。IgNAR分子可通过分子工程操纵以产生单一重链多肽的可变结构域(vNARs)(Nuttall等人，Eur.J.Biochem.270,3543
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3554(2003)；Nuttall等人，Function and Bioinformatics 55,187
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197(2004)；Dooley等人，Molecular Immunology 40,25
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33(2003))。
[0013]在1960年代确立不含轻链的仅重链抗体结合抗原的能力(Jaton等人(1968)Biochemistry,7,4185
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4195)。在物理上与轻链分开的重链免疫球蛋白相对于四聚体抗体保留80％的抗原结合活性。Sitia等人(1990)Cell,60,781
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790证实，在哺乳动物细胞培养物中，从重排小鼠μ基因去除CH1结构域可产生不含轻链的仅重链抗体。所产生的抗体保留VH结合特异性和效应功能。
[0014]可通过免疫针对多种抗原产生具有高特异性和亲和力的重链抗体(van der Linden,R.H.等人，Biochim.Biophys.Acta.1431,37
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46(1999))，并且可在酵母中容易地克隆和表达VHH部分(Frenken,本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种经分离的多特异性抗体，其包含：第一重链多肽亚基，其包含含有突变S228P、F234A、L235A和T366W的突变的人类IgG4恒定区；以及第二重链多肽亚基，其包含含有突变S228P、F234A、L235A、T366S、L368A和Y407V的突变的人类IgG4恒定区。2.如权利要求1所述的经分离的多特异性抗体，其中所述第一重链多肽亚基的所述突变的人类IgG4恒定区或所述第二重链多肽亚基的所述突变的人类IgG4恒定区缺少CH1结构域。3.如权利要求1或2所述的经分离的多特异性抗体，其中所述第一重链多肽亚基的所述突变的人类IgG4恒定区包含SEQ ID NO:73或55的序列，并且所述第二重链多肽亚基的所述突变的人类IgG4恒定区包含SEQ ID NO:72或54的序列。4.如权利要求1至3中任一项所述的经分离的多特异性抗体，其还包含对CD3具有结合特异性的第一结合部分，所述第一结合部分包含：重链可变结构域，其包含含有SEQ ID NO:36的序列的CDR1序列、含有SEQ ID NO:37的序列的CDR2序列和含有SEQ ID NO:38的序列的CDR3序列；以及轻链可变结构域，其包含含有SEQ ID NO:39的序列的CDR1序列、含有SEQ ID NO:40的序列的CDR2序列和含有SEQ ID NO:41的序列的CDR3序列。5.如权利要求4所述的经分离的多特异性抗体，其中：所述第一结合部分的所述重链可变结构域中的所述CDR1序列、所述CDR2序列和所述CDR3序列存在于人类VH框架中；并且所述第一结合部分的所述轻链可变结构域中的所述CDR1序列、所述CDR2序列和所述CDR3序列存在于人类Vκ框架中。6.如权利要求5所述的经分离的多特异性抗体，其中：所述第一结合部分的所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:42具有至少95％一致性的序列；并且所述第一结合部分的所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:43具有至少95％一致性的序列。7.如权利要求6所述的经分离的多特异性抗体，其中：所述第一结合部分的所述重链可变结构域包含所述SEQ ID NO:42的序列；并且所述第一结合部分的所述轻链可变结构域包含所述SEQ ID NO:43的序列。8.如权利要求1至7中任一项所述的经分离的多特异性抗体，其还包含对除CD3以外的蛋白质具有结合特异性的第二结合部分。9.如权利要求8所述的经分离的多特异性抗体，其中所述第二结合部分包含呈单价或二价构型的单一重链可变区。10.如权利要求9所述的经分离的多特异性抗体，其中所述第一结合部分包含轻链多肽亚基和重链多肽亚基，并且其中所述第二结合部分包含重链多肽亚基。11.如权利要求10所述的经分离的多特异性抗体，其中所述第一结合部分的所述轻链多肽亚基包含轻链恒定结构域。12.如权利要求8至11中任一项所述的经分离的多特异性抗体，其中所述除CD3以外的
蛋白质是肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。13.如权利要求12所述的经分离的多特异性抗体，其中所述TAA是B细胞成熟抗原(BCMA)。14.如权利要求12所述的经分离的多特异性抗体，其中所述TAA是CD19。15.如权利要求12所述的经分离的多特异性抗体，其中所述TAA是前列腺特异性膜抗原(PSMA)。16.一种药物组合物，其包含如权利要求1至15中任一项所述的多特异性抗体。17.一种多核苷酸，其编码如权利要求1至15中任一项所述的多特异性抗体。18.一种载体，其包含如权利要求17所述的多核苷酸。19.一种细胞，其包含如权利要求18所述的载体。20.一种产生如权利要求1至15中任一项所述的多特异性抗体的方法，其包括使如权利要求19所述的细胞在允许所述多特异性抗体表达的条件下生长并从所述细胞分离所述多特异性抗体。21.一种治疗方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的如权利要求1至15中任一项所述的多特异性抗体或如权利要求16所述的药物组合物。22.如权利要求1至15中任一项所述的多特异性抗体用于制备用来治疗有需要的个体的疾病或病症的药物的用途。23.如权利要求1至15中任一项所述的多特异性抗体或如权利要求16所述的药物组合物，其用于有需要的个体的疗法中。24.一种治疗特征在于BCMA表达的疾病或疾患的方法，其包括向有需要的个体施用有效剂量的如权利要求13所述的多特异性抗体或包含如权利要求13所述的多特异性抗体的药物组合物。25.如权利要求24所述的方法，其中所述疾病是自身免疫疾病。26.如权利要求24所...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：特尼奥生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：