一种多色免疫荧光染色方法和成像方法技术

本发明专利技术提供式(III)所示的化合物在多色免疫荧光染色中的应用，采用该方法可对样本中的多种抗原标记上多种不同的荧光染料，然后经过洗脱过程可以将上一轮染色的荧光染料洗脱掉，从而可以开始新一轮的多色免疫荧光标记。标记后的样本可用于荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜等仪器设备的成像，后期经过软件的合成，即可显示出多种不同颜色标记的样本。且各种颜色清晰、明亮、不串色。本发明专利技术既保留了基于TSA荧光染色方法的灵敏度和染色强度，又克服了其多色荧光标记数量上的限制。多色荧光标记数量上的限制。多色荧光标记数量上的限制。

【技术实现步骤摘要】
一种多色免疫荧光染色方法和成像方法


[0001]本专利技术涉及免疫检测领域，具体涉及一种多色免疫荧光染色方法和成像方法。

技术介绍

[0002]免疫荧光染色方法按技术原理大致可以分为两大类，传统免疫荧光染色方法和基于酪胺信号放大(tyramide signal amplification,TSA)的免疫荧光染色方法。
[0003]传统免疫荧光染色技术是根据抗原抗体反应原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光物质(如荧光素)制成荧光标记抗体(或抗原)，再用这种荧光标记抗体作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。最终在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物中含有荧光物质(如荧光素)，利用荧光显微镜观察样本，荧光物质受激发光的照射而发出明亮的荧光(如荧光素受激发后发出明亮的绿色的荧光)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定目标抗原(或抗体)的含量。应用不同荧光物质标记的抗体进行染色即可实现多色免疫荧光标记。传统免疫荧光染色技术进行多色免疫荧光标记的缺点一是需要制备多种荧光标记的抗体，荧光标记抗体对抗体的活性可能产生不利的影响，降低抗体检测的灵敏性。二是如果在二抗抗体上标记荧光物质，在进行多色免疫荧光标记过程中，需要额外注意多组一抗抗体和荧光标记的二抗抗体之间的种属配对关系，否则会产生交叉反应，造成假阳性的实验结果。三是染色强度较低，检测低表达量的待测目标时容易产生假阴性的结果。
[0004]酪胺信号放大技术(TSA)是在传统的免疫组化染色基础上，基于信号分子沉淀(CARD)原理，在H2O2存在时，抗体上标记的辣根过氧化物酶(HRP)将荧光物质标记的底物酪胺(T)转化为具有短暂活性的中间状态(T*)，然后被激活的底物分子迅速与相接蛋白分子的富含电子区域(酪氨酸残基)进行稳定的共价结合；由于相接蛋白(抗原、HRP等)都含有大量的酪氨酸结合位点，所以会富集大量信号，使信号被有效放大。经过多轮不同种类荧光物质标记的底物酪胺的染色，即可在一张样本上实现多色免疫荧光标记。应用TSA技术原理实现多色荧光染色的优点是，荧光信号以共价结合的方式结合到目标样本上，不易丢失，且经过HRP放大过程，信号较强。缺点是由于荧光信号的交叉作用，针对一份样本染色种类较多时，容易出现串色的情况。多色标记的数量受到了限制，一般仅仅能够做到在一张样本上进行4～7色的荧光染色。

技术实现思路

[0005]因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有应用TSA技术中需不同的荧光染料进行多色染色，不同荧光染料直接可能存在相互串色干扰的风险，且在同一样本上仅能标记有限个数待测目标的缺陷，从而提供一种应用单个荧光染料或几个荧光染料，通过循环染色从而在一个样本上实现多色免疫荧光标记的实验技术。
[0006]本专利技术提供下述式(III)所示的化合物在多色免疫荧光染色中的应用；或，下述式(III)所示的化合物在制备多色免疫荧光染色产品中的应用；
[0007][0008]其中，R5是荧光染料。
[0009]可选的，式(III)中R1、R2分别选自氢、甲基、乙基和羟基中的任意一种；
[0010]R3为将二硫键与苯环连接的任何化学基团；
[0011]R4是连接二硫键与R5连接的任何化学基团。
[0012]可选的，R3是选自
‑
CH2
‑
CH2
‑
、
‑
C＝C
‑
、酰胺键、酯键；
[0013]R4是选自
‑
CH2
‑
CH2
‑
、
‑
C＝C
‑
、酰胺键、酯键。
[0014]可选的，R5是选自香豆素类、菁类染料、荧光素类、罗丹明类、Bodipy类、和NBD胺类和其它代号系列染料中的任意一种；
[0015]可选的，所述香豆素类染料为香豆素及其衍生物中的任意一种；
[0016]可选的，所述菁类染料为CY2、CY3、CY5、CY5.5、CY7和CY7.5中的任意一种；
[0017]可选的，所述荧光素类染料为FAM，HEX，JOE和TET系列染料中的任意一种；
[0018]可选的，所述罗丹明类染料为罗丹明B、罗丹明6G和罗丹明101系列染料中的任意一种；
[0019]可选的，所述Bodipy类染料为氟化硼二吡咯类荧光染料及其衍生物中的任意一种；
[0020]可选的，所述NBD胺类染料为苯并呋咱类化合物及其衍生物中的任意一种；
[0021]可选的，所述其它代号系列染料为Alexa Fluor Dyes、mFlour Dyes、iFluor Dyes、CF Dyes系列的荧光染料及其衍生物中的任意一种；
[0022]上述化合物。
[0023]一种多色免疫荧光染色方法，包括如下步骤：采用上述化合物对目标蛋白染色后，采用β
‑
巯基乙醇，DTT或者TECP将所述化合物中的二硫键断开，还原成
‑
SH。
[0024]一种多色免疫荧光染色方法，包括如下步骤：
[0025]S1：第一轮染色
[0026]S11：第1轮第1次染色；
[0027]S111：A蛋白特异性抗体孵育样本，得到样本111；
[0028]S112：抗A蛋白特异性抗体孵育样本111，得到样本112；
[0029]S113：采用式(III)所示化合物对样本112的A蛋白染色；
[0030]S12：第1轮第2次染色
[0031]S121：B蛋白特异性抗体孵育样本，得到样本121；
[0032]S122：抗B蛋白特异性抗体孵育样本121，得到样本122；
[0033]S123：采用中式(III)所示化合物对样本122的B蛋白染色；
[0034]S13：采集图像；
[0035]S14：采用β
‑
巯基乙醇，DTT或者TECP将所述化合物中的二硫键断开，还原成
‑
SH；
[0036]S2：第2轮染色
[0037]S21：第2轮第1次染色；
[0038]S211：C蛋白特异性抗体孵育样本，得到样本211；
[0039]S212：抗C蛋白特异性抗体孵育样本211，得到样本212；
[0040]S213：采用式(III)所示化合物对样本212的C蛋白染色；
[0041]S22：第2轮第2次染色；
[0042]S221：D蛋白特异性抗体孵育样本，得到样本21；
[0043]S222：抗D蛋白特异性抗体孵育样本211，得到样本212；
[0044]S223：采用式(III)所示化合物对样本212的D蛋白染色；
[0045]S23：采集图像；
[0046]S24：采用β
‑
巯基乙醇，DTT或者TECP将所述化合物中的二硫键断开，还原成
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.下述式(III)所示的化合物在多色免疫荧光标记中的应用；或，下述式(III)所示的化合物在制备多色免疫荧光染色产品中的应用；其中，R5是荧光染料。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，式(III)中R1、R2分别选自氢、甲基、乙基和羟基中的任意一种；R3为将二硫键与苯环连接的任何化学基团；R4是连接二硫键与R5连接的任何化学基团。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，R3是选自
‑
CH2
‑
CH2
‑
、
‑
C＝C
‑
、酰胺键、酯键；R4是选自
‑
CH2
‑
CH2
‑
、
‑
C＝C
‑
、酰胺键、酯键。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的的应用，其特征在于，R5是选自香豆素类、菁类染料、荧光素类、罗丹明类、Bodipy类、和NBD胺类和其它代号系列染料中的任意一种；可选的，所述香豆素类染料为香豆素及其衍生物中的任意一种；可选的，所述菁类染料为CY2、CY3、CY5、CY5.5、CY7和CY7.5中的任意一种；可选的，所述荧光素类染料为FAM，HEX，JOE和TET系列染料中的任意一种；可选的，所述罗丹明类染料为罗丹明B、罗丹明6G和罗丹明101系列染料中的任意一种；可选的，所述Bodipy类染料为氟化硼二吡咯类荧光染料及其衍生物中的任意一种；可选的，所述NBD胺类染料为苯并呋咱类化合物及其衍生物中的任意一种；可选的，所述其它代号系列染料为Alexa Fluor Dyes、mFlour Dyes、iFluor Dyes、CF Dyes系列的荧光染料及其衍生物中的任意一种。5.权利要求1
‑
4任一中的化合物。6.一种多色免疫荧光染色方法，其特征在于，包括如下步骤：采用权利要求5所述化合物对目标蛋白染色后，采用β
‑
巯基乙醇，DTT或者TECP将所述化合物中的二硫键断开，还原成
‑
SH。7.一种多色免疫荧光染色方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：第一轮染色S11：第1轮第1次染色；S111：A蛋白特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘港，焦磊，
申请(专利权)人：佰诺全景生物技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：