一种RNA检测与定量的方法技术

本发明专利技术涉及一种适配体核酸分子，包含该适配体和荧光团小分子的复合物，该适配体核酸分子用于检测细胞内或者细胞外的RNA、DNA或者其他靶分子的方法，以及包含该适配体的试剂盒。本发明专利技术的适配体可以特异性结合一种荧光团小分子，并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。强度。强度。

【技术实现步骤摘要】
DFHBI(3，5
‑
difluoro
‑4‑
hvdroxybenzyli
‑
dene imidazolinone)为筛选靶标，获得了称为“Spinach”的核酸适配体。Spinach与DFHBI结合后，可显著增强DFHBI的荧光信号。利用Spinach
‑
DFHBI复合物，他们首次实现了在哺乳动物细胞内对靶标RNA的示踪 (Paige et al.Science.2011.333：642
‑
646)。该课题组将“Spinach”中的一个茎环结构换成可以特异性结合细胞代谢物的核酸适配体，开发了基于Spinach
‑
DFHBI复合物的可以检测细胞代谢物的工具(Paige et al.Science.2012.335：1194)。到目前为止，该方法已被成功用于细菌、酵母和哺乳动物细胞中的RNA动态变化的监测及分析。之后，该课题组对核酸适配体分子及荧光团分别做了优化，获得了Spinach2
‑
DFHBI
‑
1T，新复合物性质得到进一步提升。2014年，该课题组将SELEX与流式细胞分析术结合并筛选获得了 Broccoli(Filonov et al.Journal oftheAmerican Chemical Society.2014.136：16299
‑
16308)， Broccoli
‑
DFHBI
‑
1T相比于之前的Spinach
‑
DFHBI和Spinach2
‑
DFHBI
‑
1T，在荧光强度、稳定性等各方面均有显著的提升。但是Broccoli
‑
DFHBI
‑
1T依旧存在着镁离子依赖严重、光稳定性差的问题。2020年，该课题组对DFHBI
‑
1T进一步优化，得到新的荧光团BI，最终获得新的复合物Broccoli
‑
BI(Li et al.Angewandte Chemie International Edition inEnglish.2020.59：4511
‑
4518)。2017年，该课题组还开发了Corn
‑
DFHO复合物用于检测哺乳动物细胞RNA聚合酶III启动子的活性检测(Song et al.Nature Chemical Biology. 2017.13：1187
‑
1194)。
[0006]2019年，来自中国的杨弋教授与朱麟勇教授构成的联合攻关团队在荧光RNA领域取得了突破性进展。他们基于全新的分子设计理念设计合成了全新的荧光团分子HBC，并筛选得到了与之高度亲和的核酸适配体Pepper。同时，在HBC基础上进行化学修饰，得到一系列衍生物，与Pepper结合后的复合物光谱涵盖青色、绿色、橙色和红色。 Pepper
‑
HBC620复合物可以发出明亮的红色荧光，且有着较好的光稳定性，可以实现SIM 超分辨成像。
[0007]综上所述，目前使用的RNA标记技术都存在各自的缺点。MCP
‑
FPs标记技术存在着非特异性结合造成的本底荧光强，信噪比低。基于适配体
‑
荧光团
‑
猝灭剂构成的复合物的RNA标记技术目前只在细菌中实现对RNA的标记，还没有实现在哺乳动物细胞中标记RNA。基于单荧光团
‑
核酸适配体的RNA标记技术看起来是非常完美的RNA标记技术，然而受限于目前可供选择的可以生物正交的荧光RNA种类少，且大多数复合物位于绿色波段，存在较强镁离子依赖性，光稳定差等，因而该技术也没有被广泛使用。因此，科研界和产业界一直都需要更加有效的荧光团
‑
核酸适配体复合物，能克服此前荧光团
‑
核酸适配体复合物的缺点，用于活细胞中的RNA或DNA的实时标记。
[0008]专利技术的简述
[0009]本专利技术提供了一种核酸适配体分子，编码该核酸适配体分子的DNA分子，一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物，以及该复合物的用途。
[0010]本专利技术提供的技术方案如下：
[0011]1.一种核酸适配体分子，所述适配体分子包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c)：
[0012](a)核苷酸序列为：N1UGUAGUAN9‑
N
10
‑
N
11
GGAAGAAUUGAUCUCGGN
29
，其中N1、N9、N
10
、N
11
和N
29
代表长度≥1个的核苷酸片段，并且N1和N
29
核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对，N9和N
u
核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对；
[0013](b)与(a)限定的核苷酸序列具有至少58％同一性的核苷酸序列；
[0014](c)在(a)限定的核苷酸序列中不包括N1、N9、N
10
、N
11
和N
29
的位置，经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或添加，且具有适配体功能的由(a)衍生的核酸适配体分子。
[0015]2.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中与(a)所述的Paprika结构核苷酸序列具有至少58％，63％，67％，71％，75％，79％，83％，94％，96％，98％或100％同一性的序列。
[0016]3.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的Paprika结构核苷酸序列中不包括N1、N9、N
10
、N
11
和N
29
的位置，经过10个、9 个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代、缺失和/或添加而得到的核酸适配体分子。
[0017]4.根据权利要求3所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的核苷酸序列中不包括N1、N9、N
10
、N
11
和N
29
的位置，经过7个、6个、5个、4 个、3个、2个或1个核苷酸的取代而得到的核酸适配体分子。
[0018]5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的 N1与N
29
互补配对时，N1核苷酸序列的方向为5
’‑3’
，N
29
核苷酸序列的方向为3
’‑5’
； N9与N
11
互补配对时，N9核苷酸序列的方向为5
’‑3’
，N
11
核苷酸序列的方向为3
’‑5’
。
[0019]6.根据权利要求5所述的核酸适配体分子，其中当N1与N
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸适配体分子，所述适配体分子包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c)：(a)核苷酸序列为：N1UGUAGUAN9‑
N
10
‑
N
11
GGAAGAAUUGAUCUCGGN
29
，其中N1、N9、N
10
、N
11
和N
29
代表长度≥1个的核苷酸片段，并且N1和N
29
核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对，N9和N
11
核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对；(b)与(a)限定的核苷酸序列具有至少58％同一性的核苷酸序列；(c)在(a)限定的核苷酸序列中不包括N1、N9、N
10
、N
11
和N
29
的位置，经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或添加，且具有适配体功能的由(a)衍生的核酸适配体分子。2.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中与(a)所述的Paprika结构核苷酸序列具有至少58％，63％，67％，71％，75％，79％，83％，94％，96％，98％或100％同一性的序列。3.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的Paprika结构核苷酸序列中不包括N1、N9、N
10
、N
11
和N
29
的位置，经过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代、缺失和/或添加而得到的核酸适配体分子。4.根据权利要求3所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的核苷酸序列中不包括N1、N9、N
10
、N
11
和N
29
的位置，经过7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代而得到的核酸适配体分子。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的N1与N
29
互补配对时，N1核苷酸序列的方向为5
’‑3’
，N
29
核苷酸序列的方向为3
’‑5’
；N9与N
11
互补配对时，N9核苷酸序列的方向为5
’‑3’
，N
11
核苷酸序列的方向为3
’‑5’
。6.根据权利要求5所述的核酸适配体分子，其中当N1与N
29
中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则N1与N
29
核苷酸序列中至少有两对核苷酸碱基形成互补配对；当N9与N
11
中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则N9与N
11
核苷酸序列中至少有两对碱基形成互补配对。7.根据权利要求1
‑
6任一项所述的核酸适配体分子，其中对通式Paprika结构的核苷酸取代选自下组中的一种：U2A、U2C、U2G、G3A、G3U、G3C、U4A、U4C、U4G、A5U、A5C、A5G、G6A、G6U、G6C、U7A、U7C、U7G、A8U、A8C、A8G、G12A、G12U、G12C、G13A、G13U、G13C、A14U、A14C、A14G、A15U、A15C、A15G、G16A、G16U、G16C、A17U、A17C、A17G、A18U、A18C、A18G、U19A、U19C、U19G、U20A、U20C、U20G、G21A、G21U、G21C、A22U、A22C、A22G、U23A、U23C、U23G、C24A、C24U、C24G、U25A、U25C、U25G、C26A、C26U、C26G、G27A、G27U、G27C、G28A、G28U、G28C、A5U/U25A、A5C/U25G、A5G/U25C、G6A/C24U、G6U/C24A、G6C/C24G、U4A/G12A、U4A/G13U、U4A/G16A、U4A/U20C、U4A/A22C、G12A/G13U、G12A/G16A、G12A/U20C、G12A/A22C、G13U/G16A、G13U/U20C、G13U/A22C、G16A/U20C、G16A/A22C、U20C/A22C、U4A/G12A/G13U、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/A22C、G12A/G13U/G16A、G12A/G13U/U20C、G12A/G13U/A22C、G13U/G16A/U20C、G13U/G16A/A22C、G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/G16A/U20C、U4A/G12A/G13U/G16A/A22C、U4A/G13U/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/U20C/A22C、A5U/U25A/U4A/G12A/G13U、A5U/U25A/U4A/G12A/G16A、A5U/U25A//U4A/G12A/G16A、G6A/C24U/U4A/G12A/A22C、G6A/C24U/G12A/G13U/G16A、G6A/C24U/G12A/G13U/U20C、G6A/C24U/G12A/G13U/A22C。8.根据权利要求7所述的核酸适配体分子，其中对通式Paprika结构的核苷酸取代选自下组中的一种：U2A、U2C、U2G、U4A、U4C、U4G、A5C、A5G、G6U、U7A、U7C、U7G、A8U、A8C、A8G、
G12A、G12U、G12C、G13A、G13U、G13C、A14U、A14C、A14G、A15U、A15C、A15G、G16A、G16U、G16C、A17U、A17C、A17G、A18U、A18C、U19A、U19C、U19G、U20A、U20C、U20G、G21A、G21U、A22U、A22C、A22G、U23A、U23C、U23G、C24A、C24U、C24G、U25A、U25C、C26A、C26U、G27A、G27U、G27C、G28A、G28U、G28C、A5U/U25A、A5C/U25G、A5G/U25C、G6A/C24U、G6U/C24A、G6C/C24G、U4A/G12A、U4A/G13U、U4A/G16A、U4A/U20C、U4A/A22C、G12A/G13U、G12A/G16A、G12A/U20C、G12A/A22C、G13U/G16A、G13U/U20C、G13U/A22C、G16A/U20C、G16A/A22C、U20C/A22C、U4A/G12A/G13U、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/A22C、G12A/G13U/G16A、G12A/G13U/U20C、G12A/G13U/A22C、G13U/G16A/U20C、G13U/G16A/A22C、G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/G16A/U20C、U4A/G12A/G13U/G16A/A22C、U4A/G13U/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/U20C/A22C、A5U/U25A/U4A/G12A/G13U、A5U/U25A/U4A/G12A/G16A、A5U/U25A//U4A/G12A/G16A、G6A/C24U/U4A/G12A/A22C、G6A/C24U/G12A/G13U/G16A、G6A/C24U/G12A/G13U/U20C、G6A/C24U/G12A/G13U/A22C。9.根据权利要求8所述的核酸适配体分子，其中对通式Paprika结构的核苷酸取代选自下组中的一种：U2A、U2C、U2G、U4A、U4C、U4G、A5C、A5G、G6U、U7C、U7G、A8U、A8C、A8G、G12A、G12U、G12C、G13A、G13U、G13C、A14U、A14C、A14G、A15U、A15C、A15G、G16A、G16U、G16C、A17U、A17C、A17G、U19A、U19C、U20A、U20C、U20G、G21U、A22U、A22C、A22G、U23A、U23C、U23G、C24A、C24G、U25C、C26U、G27A、G27U、G27C、G28A、G28U、G28C、A5U/U25A、A5C/U25G、A5G/U25C、G6A/C24U、G6U/C24A、G6C/C24G、U4A/G12A、U4A/G13U、U4A/G16A、U4A/U20C、U4A/A22C、G12A/G13U、G12A/G16A、G12A/U20C、G12A/A22C、G13U/G16A、G13U/U20C、G13U/A22C、G16A/U20C、G16A/A22C、U20C/A22C、U4A/G12A/G13U、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/G16A、U4A/G12A/A22C、G12A/G13U/G16A、G12A/G13U/U20C、G12A/G13U/A22C、G13U/G16A/U20C、G13U/G16A/A22C、G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/G16A/U20C、U4A/G12A/G13U/G16A/A22C、U4A/G13U/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G16A/U20C/A22C、U4A/G12A/G13U/U20C/A22C、A5U/U25A/U4A/G12A/G13U、A5U/U25A/U4A/G12A/G16A、A5U/U25A//U4A/G12A/G16A、G6A/C24U/U4A/G12A/A22C、G6A/C24U/G12A/G13U/G16A、G6A/C24U/G12A/G13U/U20C、G6A/C24U/G12A/G13U/A22C。10.根据权利要求1
‑
9所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的N1与N
29
处的核苷酸序列为F30或tRNA脚手架RNA序列。11.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是RNA分子或经碱基修饰的RNA分子。12.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是DNA
‑
RNA杂交分子或经碱基修饰的DNA
‑
RNA分子。13.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，所述的适配体功能是指核酸适配体能提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度至少2倍，至少5
‑
10倍，至少20
‑
50倍，至少100
‑
200倍，至少200
‑
1000倍或者至少1000
‑
5000倍。14.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中还可包含可以结合多个荧光团分子串联体，所述串联体通过适当长度的间隔序列连在一起，个数可以是2、3、4、5、6、7、8或者更多。所述串联体的核苷酸可选自但不限于序列SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。15.一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物，其中所述的核酸适配体分子为权利
要求1
‑
14任一项所述核酸适配体分子，所述的荧光团分子具有下述式(I)所述的结构：电子供体部分
‑
D为
‑
NX1
‑
X2，X1选自氢、烷基、或改性烷基，X2选自氢、烷基、或改性烷基，X1，X2任选相互连接，与N原子一起形成脂杂环；共轭体系E为选自双键、叁键、芳香环、芳香杂环中的至少一种共轭连接而形成，其中所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、羟基、氨基、伯氨基、仲氨基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成脂环或脂杂环；X1，X2，独立地与共轭结构E连接成脂杂环；电子受体A部分如下式(I
‑1‑
a)的环状结构：Ra独立地选自氢、卤原子、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基；R
b
独立地选自氢、卤原子、羟基、羧基、氨基、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基或者为双键与芳香环、芳香杂环中的至少一种共轭连接而形成的基团；各个Y1独立地选自
‑
O
‑
、
‑
S
‑
、
‑
(S＝O)
‑
和
‑
(NR
i
)
‑
，其中R
i
选自氢、氨基、烷基或改性烷基；各个Y2独立地选自＝O、＝S、＝S＝O和＝NR
i
，其中R
i
选自氢、烷基或改性烷基；各个Y3独立地选自＝O、＝S、＝S＝O和＝NR
i
，其中R
i
选自氢、烷基或改性烷基；或者，各个Y3独立地为＝C(R
e
)(CN)；其中R
e
选自氢、酯基、...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大生，
申请(专利权)人：纳莹上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：