【技术实现步骤摘要】
一种RNA适配体分子及其与荧光团小分子复合物和应用
[0001]本专利技术涉及一种适配体核酸分子,该适配体核酸分子用于检测细胞内或者细胞外的RNA、DNA或者其他靶分子的方法,以及包含该适配体的试剂盒。本专利技术的适配体可以特异性结合一种荧光团小分子,并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。
技术介绍
[0002]在活细胞中,RNA具有独特的结构、种类繁多的生物学功能以及复杂的时间空间分布。对不同种类的RNA及其修饰形式的鉴定、功能与调控研究现已经成为了国际前沿。开发技术对它们进行实时示踪和分析,对于理解各种细胞生命过程至关重要。
[0003]目前,对于RNA成像的比较成熟的技术手段,主要有以下几种,RNA荧光原位杂交技术、分子信标技术、RNA结合蛋白
‑
荧光蛋白MCP
‑
FPs系统和荧光RNA技术。其中,RNA荧光原位杂交技术是长期以来被广泛用于来研究RNA在细胞内水平与分布的方法,它是通过分子杂交对特异RNA分子进行荧光标记,进而进行成像的技术。然而其操作较复杂且含有洗脱步骤,只能用于固定化细胞即死细胞的研究,不能用于实时监测活细胞中RNA的动态变化过程。而分子信标技术是最早发展起来的活细胞RNA成像技术。它是一种在5
’
和3
’
末端自身形成发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针,当其与靶标RNA结合后,标记在一端的猝灭基团对荧光基团的猝灭作用消除,荧光基团产生荧光,或者两端荧光基团的FRET消失。然而分子信标存在着荧光信号偏低、进细胞困
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种核酸适配体分子,所述适配体分子包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c):(a)核苷酸序列为:N1AACGN6‑
N7‑
N8GAGUCACUACGAGAGUAUN
27
,其中N1、N6、N7、N8和N
27
代表长度≥1个的核苷酸片段,并且N1和N
27
核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对,N6和N8核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对;(b)与(a)限定的核苷酸序列具有至少55%同一性的核苷酸序列;(c)在(a)限定的核苷酸序列中不包括N1、N6、N7、N8和N
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的位置,经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或添加,且具有适配体功能的由(a)衍生的核酸适配体分子。2.根据权利要求1所述的核酸适配体分子,其中与(a)所述的IA7结构核苷酸序列具有至少55%,59%,64%,68%,73%,77%,82%,86%,91%,95%或100%同一性的序列。3.根据权利要求1所述的核酸适配体分子,其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的IA7结构核苷酸序列中不包括N1、N6、N7、N8和N
27
的位置,经过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代、缺失和/或添加而得到的核酸适配体分子。4.根据权利要求3所述的核酸适配体分子,其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的核苷酸序列中不包括N1、N6、N7、N8和N
27
的位置,经过7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代而得到的核酸适配体分子。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的核酸适配体分子,其中核苷酸序列(a)中的N1与N
27
互补配对时,N1核苷酸序列的方向为5
’‑3’
,N
27
核苷酸序列的方向为3
’‑5’
;N6与N8互补配对时,N6核苷酸序列的方向为5
’‑3’
,N8核苷酸序列的方向为3
’‑5’
。6.根据权利要求5所述的核酸适配体分子,其中当N1与N
27
中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时,则N1与N
27
核苷酸序列中至少有两对核苷酸碱基形成互补配对;当N6与N8中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时,则N6与N8核苷酸序列中至少有两对碱基形成互补配对。7.根据权利要求1
‑
6任一项所述的核酸适配体分子,其中对通式IA7结构的核苷酸取代选自下组中的一种:A2U、A2C、A2G、A3U、A3C、A3G、C4A、C4U、C4G、G5A、G5U、G5C、G9A、G9U、G9C、A10U、A10C、A10G、G11A、G11U、G11C、U12A、U12C、U12G、C13A、C13U、C13G、A14U、A14C、A14G、C15A、C15U、C15G、U16A、U16C、U16G、A17U、A17C、A17G、C18A、C18U、C18G、G19A、G19U、G19C、A20U、A20C、A20G、G21A、G21U、G21C、A22U、A22C、A22G、G23A、G23U、G23C、U24A、U24C、U24G、A25U、A25C、A25G、U26A、U26C、U26G、U12A/A14G、U12A/C15U、U12A/C15G、U12A/U16A、U12A/U16C、U12A/A17U、U12A/C18A、U12A/C18U、A14G/C15U、A14G/C15G、A14G/U16A、A14G/U16C、A14G/A17U、A14G/C18A、A14G/C18U、C15U/U16A、C15U/U16C、C15U/A17U、C15U/C18A、C15U/C18U、C15G/U16A、C15G/U16C、C15G/A17U、C15G/C18A、C15G/C18U、U16A/A17U、U16A/C18A、U16A/C18U、U16G/A17U、U16G/C18A、U16G/C18U、A17U/C18A、A17U/C18U、U12A/C15U/U16A、U12A/C15U/U16C、U12A/C15U/A17U、U12A/C15U/C18A、U12A/C15U/C18U、U12A/C15G/U16A、U12A/C15G/U16C、U12A/C15G/A17U、U12A/C15G/C18A、U12A/C15G/C18U、U12A/U16A/A17U、U12A/U16A/C18A、U12A/U16A/C18U、U12A/U16C/A17U、U12A/U16C/C18A、U12A/U16C/C18U、U12A/A17U/C18A、U12A/A17U/C18U、C15U/U16C/A17U、C15U/U16C/C18A、C15U/U16C/C18U、U16C/A17U/C18A、U16C/A17U/C18U、C15G/U16C/A17U、C15G/U16C/C18A、C15G/U16C/C18U、U16A/A17U/C18A、U16A/A17U/C18U、C15G/U16C/A17U、C15G/U16C/C18A、C15G/U16C/C18U、U12A/C15U/U16C/A17U、U12A/C15U/U16C/C18A、U12A/C15U/U16C/C18U、C15U/U16C/A17U/
C18A、C15U/U16C/A17U/C18U、U12A/C15U/U16C/A17U/C18A、U12A/C15U/U16C/A17U/C18U。8.根据权利要求7所述的核酸适配体分子,其中对通式IA7结构的核苷酸取代选自下组中的一种:A3U、A3C、A3G、C4U、C4G、G5A、G5U、G5C、G9A、G9U、G9C、A10U、A10C、A10G、G11A、G11U、G11C、U12A、U12C、U12G、C13A、C13U、C13G、A14U、A14C、A14G、C15A、C15U、C15G、U16A、U16C、U16G、A17U、A17C、A17G、C18A、C18U、C18G、G19A、G19U、G19C、A20U、A20C、A20G、G21A、G21U、G21C、A22U、A22C、A22G、G23A、G23U、G23C、U24A、U24C、U24G、A25U、A25C、A25G、U26C、U12A/A14G、U12A/C15U、U12A/C15G、U12A/U16A、U12A/U16C、U12A/A17U、U12A/C18A、U12A/C18U、A14G/C15U、A14G/C15G、A14G/U16A、A14G/U16C、A14G/A17U、A14G/C18A、A14G/C18U、C15U/U16A、C15U/U16C、C15U/A17U、C15U/C18A、C15U/C18U、C15G/U16A、C15G/U16C、C15G/A17U、C15G/C18A、C15G/C18U、U16A/A17U、U16A/C18A、U16A/C18U、U16G/A17U、U16G/C18A、U16G/C18U、A17U/C18A、A17U/C18U、U12A/C15U/U16A、U12A/C15U/U16C、U12A/C15U/A17U、U12A/C15U/C18A、U12A/C15U/C18U、U12A/C15G/U16A、U12A/C15G/U16C、U12A/C15G/A17U、U12A/C15G/C18A、U12A/C15G/C18U、U12A/U16A/A17U、U12A/U16A/C18A、U12A/U16A/C18U、U12A/U16C/A17U、U12A/U16C/C18A、U12A/U16C/C18U、U12A/A17U/C18A、U12A/A17U/C18U、C15U/U16C/A17U、C15U/U16C/C18A、C15U/U16C/C18U、U16C/A17U/C18A、U16C/A17U/C18U、C15G/U16C/A17U、C15G/U16C/C18A、C15G/U16C/C18U、U16A/A17U/C18A、U16A/A17U/C18U、C15G/U16C/A17U、C15G/U16C/C18A、C15G/U16C/C18U、U12A/C15U/U16C/A17U、U12A/C15U/U16C/C18A、U12A/C15U/U16C/C18U、C15U/U16C/A17U/C18A、C15U/U16C/A17U/C18U、U12A/C15U/U16C/A17U/C18A、U12A/C15U/U16C/A17U/C18U。9.根据权利要求8所述的核酸适配体分子,其中对通式IA7结构的核苷酸取代选自下组中的一种:A3U、C4U、C4G、G5A、G5U、G5C、G9U、A10U、A10C、G11U、U12A、U12C、U12G、C13A、C13G、A14U、A14C、A14G、C15A、C15U、C15G、U16A、U16C、U16G、A17U、A17C、A17G、C18A、C18U、C18G、A20U、A20C、A20G、G21A、G21U、G21C、A22U、A22C、A22G、G23A、G23C、U24C、A25U、A25G、U26C、U12A/A14G、U12A/C15U、U12A/C15G、U12A/U16A、U12A/U16C、U12A/A17U、U12A/C18A、U12A/C18U、A14G/C15U、A14G/C15G、A14G/U16A、A14G/U16C、A14G/A17U、A14G/C18A、A14G/C18U、C15U/U16A、C15U/U16C、C15U/A17U、C15U/C18A、C15U/C18U、C15G/U16A、C15G/U16C、C15G/A17U、C15G/C18A、C15G/C18U、U16A/A17U、U16A/C18A、U16A/C18U、U16G/A17U、U16G/C18A、U16G/C18U、A17U/C18A、A17U/C18U、U12A/C15U/U16A、U12A/C15U/U16C、U12A/C15U/A17U、U12A/C15U/C18A、U12A/C15U/C18U、U12A/C15G/U16A、U12A/C15G/U16C、U12A/C15G/A17U、U12A/C15G/C18A、U12A/C15G/C18U、U12A/U16A/A17U、U12A/U16A/C18A、U12A/U16A/C18U、U12A/U16C/A17U、U12A/U16C/C18A、U12A/U16C/C18U、U12A/A17U/C18A、U12A/A17U/C18U、C15U/U16C/A17U、C15U/U16C/C18A、C15U/U16C/C18U、U16C/A17U/C18A、U16C/A17U/C18U、C15G/U16C/A17U、C15G/U16C/C18A、C15G/U16C/C18U、U16A/A17U/C18A、U16A/A17U/C18U、C15G/U16C/A17U、C15G/U16C/C18A、C15G/U16C/C18U、U12A/C15U/U16C/A17U、U12A/C15U/U16C/C18A、U12A/C15U/U16C/C18U、C15U/U16C/A17U/C18A、C15U/U16C/A17U/C18U、U12A/C15U/U16C/A17U/C18A、U12A/C15U/U16C/A17U/C18U。10.根据权利要求1
‑
9所述的核酸适配体分子,其中核苷酸序列(a)中的N1与N
27
处的核苷酸序列为F30或tRNA脚手架RNA序列。11.根据前述任一项所述的核酸适配体分子,其中的适配体分子是RNA分子或经碱基修
饰的RNA分子。12.根据前述任一项所述的核酸适配体分子,其中的适配体分子是DNA
‑
RNA杂交分子或经碱基修饰的DNA
‑
RNA分子。13.根据前述任一项所述的核酸适配体分子,所述的适配体功能是指核酸适配体能提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度至少2倍,至少5
‑
10倍,至少20
‑
50倍,至少100
‑
200倍,至少200
‑
1000倍或者至少1000
‑
5000倍。14.根据权利要求1所述的核酸适配体分子,其中还可包含可以结合多个荧光团分子串联体,所述串联体通过适当长度的间隔序列连在一起,个数可以是2、3、4、5、6、7、8或者更多。所述串联体的核苷酸可选自但不限于序列SEQ ID No:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。15.一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物,其中所述的核酸适配体分子为权利要求1
‑
14任一项所述核酸适配体分子,所述的荧光团分子具有下述式(I)所述的结构:电子供体部分
‑
D为
‑
NX1
‑
X2,X1选自氢、烷基、或改性烷基,X2选自氢、烷基、或改性烷基,X1,X2任选相互连接,与N原子一起形成脂杂环;共轭体系E为选自双键、叁键、芳香环、芳香杂环中的至少一种共轭连接而形成,其中所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、羟基、氨基、伯氨基、仲氨基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代,所述取代基任选地相互连接构成脂环或脂杂环;X1,X2,独立地与共轭结构E连接成脂杂环;电子受体A部分如下式(I
‑1‑
a)的环状结构:Ra独立地选自氢、卤原子、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基;R
b
独立地选自氢、卤原子、羟基、羧基、氨基、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基或者为双键与芳香环、芳香杂环中的至少一种共轭连接而形成的基团;各个Y1独立地选自
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O
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、
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