一种新型RNA核酸分子及其复合物和应用制造技术

一种新型RNA核酸分子及其复合物和应用。本发明专利技术涉及一种适配体核酸分子，包含该适配体和荧光团小分子的复合物，该适配体核酸分子用于检测细胞内或者细胞外的RNA、DNA或者其他靶分子的方法，以及包含该适配体的试剂盒。本发明专利技术的适配体可以特异性结合一种荧光团小分子，并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。

【技术实现步骤摘要】
一种新型RNA核酸分子及其复合物和应用


[0001]本专利技术涉及一种适配体核酸分子，该适配体核酸分子用于检测细胞内或者细胞外的RNA、DNA或者其他靶分子的方法，以及包含该适配体的试剂盒。本专利技术的适配体可以特异性结合一种荧光团小分子，并显著提高其在合适波长光激发下的荧光强度。

技术介绍

[0002]细胞中的RNA种类繁多且功能复杂。近年来兴起的荧光RNA可实现对活细胞中RNA的高时空分辨成像，帮助科研人员更加直观的了解RNA在细胞中的动态，同时为疾病的诊断提供强有力的新工具。
[0003]目前，对于RNA成像的比较成熟的技术手段，主要有以下几种，RNA荧光原位杂交技术、分子信标技术、RNA结合蛋白
‑
荧光蛋白MCP
‑
FPs系统和荧光RNA技术：
[0004]1、RNA荧光原位杂交技术是长期以来被广泛用于来研究RNA在细胞内水平与分布的方法，它是通过分子杂交对特异RNA分子进行荧光标记，进而进行成像的技术。然而其操作较复杂且含有洗脱步骤，只能用于固定化细胞即死细胞的研究，不能用于实时监测活细胞中RNA的动态变化过程。
[0005]2、分子信标技术是最早发展起来的活细胞RNA成像技术。它是一种在5
’
和3
’
末端自身形成发夹结构的茎
‑
环双标记寡核苷酸探针，当其与靶标RNA结合后，标记在一端的猝灭基团对荧光基团的猝灭作用消除，荧光基团产生荧光，或者两端荧光基团的FRET消失。然而分子信标存在着荧光信号偏低、进细胞困难、易降解、较严重的细胞核内非特异性聚集、易受RNA二级结构的影响且需要对每条RNA专门定制寡核苷酸探针等缺点，这些缺点限制了该技术的广泛应用。
[0006]3、利用MCP
‑
FPs系统，MCP
‑
FPs可以特异性识别结合融合了多拷贝MS2序列的mRNA分子，通过检测荧光蛋白的信号实时监测mRNA的合成及分布(Ozawa et al.Nature Methods.2007.4:413
‑
419)是目前用于活细胞RNA成像的主要方法。但由于未结合mRNA分子的MCP
‑
FPs会产生很高的本底荧光，使得该方法的信噪比很低。随后，科学家们将MCP
‑
FPs融合蛋白加上核定位信号，使得没有与mRNA分子结合的GFP
‑
MS2定位细胞核中，一定程度降低了细胞胞浆中的非特异荧光，提高了检测的信噪比。
[0007]4、荧光RNA技术最早可追溯到2003年.荧光蛋白的诺贝尔化学奖获得者之一钱永健(Roger Tsien)教授提出可以利用RNA适配体特异性识别结合并激活染料分子，进而实现对RNA的可视化。基于这样的原理，他的课题组筛选获得了可以结合并激活三苯甲烷染料孔雀石绿(MG)染料分子，荧光增强倍数可达2360倍。可惜的是，由于MG本身是生物染色剂，因而不能用于活细胞RNA标记。该技术真正可以应用与活细胞则是2011年S.Jaffrey课题组利用SELEX方法，以绿色荧光蛋白生色团HBI的衍生物DFHBI(3,5
‑
difluoro
‑4‑
hydroxybenzyli
‑
dene imidazolinone)为筛选靶标，获得了称为“Spinach”的核酸适配体。Spinach与DFHBI结合后，可显著增强DFHBI的荧光信号。利用Spinach
‑
DFHBI复合物，他们首次实现了在哺乳动物细胞内对靶标RNA的示踪(Paige et al.Science.2011.333:642
‑
646)。到目前为止，该方法已被成功用于细菌、酵母和哺乳动物细胞中的RNA动态变化的监测及分析。之后，该课题组对核酸适配体分子及荧光团分别做了优化，获得了Spinach2
‑
DFHBI
‑
1T，Broccoli
‑
DFHBI
‑
1T(Filonov et al.Journal of the American Chemical Society.2014.136:16299
‑
16308)和Broccoli
‑
BI(Li et al.Angewandte Chemie International Edition in English.2020.59:4511
‑
4518)。2017年，该课题组还开发了Corn
‑
DFHO复合物用于检测哺乳动物细胞RNA聚合酶III启动子的活性检测(Song et al.Nature Chemical Biology.2017.13:1187
‑
1194)。2019年，来自中国的杨弋教授与朱麟勇教授构成的联合攻关团队在荧光RNA领域取得了突破性进展。他们基于全新的分子设计理念设计合成了全新的荧光团分子HBC，并筛选得到了与之高度亲和的核酸适配体Pepper。同时，在HBC基础上进行化学修饰，得到一系列衍生物，与Pepper结合后的复合物光谱涵盖青色、绿色、橙色和红色。Pepper
‑
HBC620复合物可以发出明亮的红色荧光，且有着较好的光稳定性，可以实现SIM超分辨成像。
[0008]综上所述，目前使用的RNA标记技术都存在各自的缺点。MCP
‑
FPs标记技术存在着非特异性结合造成的本底荧光强，信噪比低。基于适配体
‑
荧光团
‑
猝灭剂构成的复合物的RNA标记技术目前只在细菌中实现对RNA的标记，还没有实现在哺乳动物细胞中标记RNA。基于单荧光团
‑
核酸适配体的RNA标记技术看起来是非常完美的RNA标记技术，然而受限于目前可供选择的可以生物正交的荧光RNA种类少，且大多数复合物位于绿色波段，存在较强镁离子依赖性，光稳定差等，因而该技术也没有被广泛使用。因此，科研界和产业界一直都需要更加有效的荧光团
‑
核酸适配体复合物，能克服此前荧光团
‑
核酸适配体复合物的缺点，用于活细胞中的RNA或DNA的实时标记。
[0009]专利技术的简述
[0010]本专利技术提供了一种核酸适配体分子，编码该核酸适配体分子的DNA分子，一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物，以及该复合物的用途。
[0011]本专利技术提供的技术方案如下：
[0012]1.一种核酸适配体分子，所述适配体分子包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c)：
[0013](a)核苷酸序列为：N1GAUUAACGAAAGN
14
‑
N
15
‑
N
16
GCGACN
22
，其中N1、N
14
、N
15
、N
16
和N
22本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸适配体分子，所述适配体分子包含下述核苷酸序列(a)、(b)或(c)：(a)核苷酸序列为：N1GAUUAACGAAAGN
14
‑
N
15
‑
N
16
GCGACN
22
，其中N1、N
14
、N
15
、N
16
和N
22
代表长度≥1个的核苷酸片段，并且N1和N
22
核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对，N
14
和N
16
核苷酸序列中至少有一对碱基形成互补配对；(b)与(a)限定的核苷酸序列具有至少41％同一性的核苷酸序列；(c)在(a)限定的核苷酸序列中不包括N1、N
14
、N
15
、N
16
和N
22
的位置，经过一个或几个核苷酸的取代、缺失和/或添加，且具有适配体功能的由(a)衍生的核酸适配体分子。2.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中与(a)所述的N168结构核苷酸序列具有至少41％，47％，53％，59％，65％，71％，76％，82％，88％，94％或100％同一性的序列。3.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的N16结构核苷酸序列中不包括N1、N
14
、N
15
、N
16
和N
22
的位置，经过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代、缺失和/或添加而得到的核酸适配体分子。4.根据权利要求3所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(c)是在(a)限定的核苷酸序列中不包括N1、N
14
、N
15
、N
16
和N
22
的位置，经过7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸的取代而得到的核酸适配体分子。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的N1与N
22
互补配对时，N1核苷酸序列的方向为5
’‑3’
，N
22
核苷酸序列的方向为3
’‑5’
；N
14
与N
16
互补配对时，N
14
核苷酸序列的方向为5
’‑3’
，N
16
核苷酸序列的方向为3
’‑5’
。6.根据权利要求5所述的核酸适配体分子，其中当N1与N
22
中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则N1与N
22
核苷酸序列中至少有两对核苷酸碱基形成互补配对；当N
14
与N
16
中的至少一条片段的长度≥5个核苷酸碱基时，则N
14
与N
16
核苷酸序列中至少有两对碱基形成互补配对。7.根据权利要求1
‑
6任一项所述的核酸适配体分子，其中对通式N168结构的核苷酸取代选自下组中的一种：G2A、G2U、G2C、A3U、A3C、A3G、U4A、U4C、U4G、U5A、U5C、U5G、A6U、A6C、A6G、A7U、A7C、A7G、C8A、C8U、C8G、G9A、G9U、G9C、A10U、A10C、A10G、A11U、A11C、A11G、A12U、A12C、A12G、G13A、G13U、G13C、G17A、G17U、G17C、C18A、C18U、C18G、G19A、G19U、G19C、A20U、A20C、A20G、C21A、C21U、C21G、U4G/U5A、U4G/A6U、U4G/A10C、U4G/A12U、U5A/A6U、U5A/A10C、U5A/A12U、A6U/A10C、A6U/A12U、A10C/A12U、U4G/U5A/A6U、U4G/U5A/A10C、U4G/U5A/A12U、U5A/A6U/A10C、U5A/A6U/A12U、A6U/A10C/A12U、U4G/U5A/A6U/A10C、U4G/U5A/A6U/A12U、U4G/A6U/A10C/A12U、U5A/A6U/A10C/A12U、U4G/U5A/A6U/A10C/A12U。8.根据权利要求7所述的核酸适配体分子，其中对通式N168结构的核苷酸取代选自下组中的一种：G2A、G2U、G2C、U4A、U4C、U4G、U5A、U5C、U5G、A6U、A6C、A6G、A7U、C8A、C8U、C8G、G9A、G9U、G9C、A10U、A10C、A10G、A11U、A11G、A12U、A12C、A12G、C18A、C18U、C18G、G19A、G19U、G19C、A20U、C21A、C21U、C21G、U4G/U5A、U4G/A6U、U4G/A10C、U4G/A12U、U5A/A6U、U5A/A10C、U5A/A12U、A6U/A10C、A6U/A12U、A10C/A12U、U4G/U5A/A6U、U4G/U5A/A10C、U4G/U5A/A12U、U5A/A6U/A10C、U5A/A6U/A12U、A6U/A10C/A12U、U4G/U5A/A6U/A10C、U4G/U5A/A6U/A12U、U4G/A6U/A10C/A12U、U5A/A6U/A10C/A12U、U4G/U5A/A6U/A10C/A12U。9.根据权利要求8所述的核酸适配体分子，其中对通式N168结构的核苷酸取代选自下组中的一种：G2U、U4A、U4C、U4G、U5A、U5C、U5G、A6U、A6G、A10U、A10C、A10G、A11U、A12U、A12C、
U4G/U5A、U4G/A6U、U4G/A10C、U4G/A12U、U5A/A6U、U5A/A10C、U5A/A12U、A6U/A10C、A6U/A12U、A10C/A12U、U4G/U5A/A6U、U4G/U5A/A10C、U4G/U5A/A12U、U5A/A6U/A10C、U5A/A6U/A12U、A6U/A10C/A12U、U4G/U5A/A6U/A10C、U4G/U5A/A6U/A12U、U4G/A6U/A10C/A12U、U5A/A6U/A10C/A12U、U4G/U5A/A6U/A10C/A12U。10.根据权利要求1
‑
9所述的核酸适配体分子，其中核苷酸序列(a)中的N1与N
22
处的核苷酸序列为F30或tRNA脚手架RNA序列。11.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是RNA分子或经碱基修饰的RNA分子。12.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的适配体分子是DNA
‑
RNA杂交分子或经碱基修饰的DNA
‑
RNA分子。13.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，其中的N
14
‑
N
15
‑
N
16
包含一个可以识别靶标分子的核苷酸序列。14.根据权利要求13所述的核酸适配体分子，其中的靶标分子包括但不限于：蛋白质，核酸，脂质分子，碳水化合物，激素，细胞因子，趋化因子，代谢物金属离子。15.根据权利要求13或14所述的核酸适配体分子，其中的N
14
‑
N
15
‑
N
16
为可以识别GTP和腺苷分子的核苷酸序列。16.根据前述任一项所述的核酸适配体分子，所述的适配体功能是指核酸适配体能提高荧光团分子在合适波长激发光下的荧光强度至少2倍，至少5
‑
10倍，至少20
‑
50倍，至少100
‑
200倍或者200
‑
1000倍。17.根据权利要求1所述的核酸适配体分子，其中还可包含可以结合多个荧光团分串联体，所述串联体通过适当长度的间隔序列连在一起，个数可以是2、3、4、5、6、7、8或者更多。所述串联体的核苷酸可选自但不限于序列SEQ ID No：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13。18.一种核酸适配体分子与荧光团分子的复合物，其中所述的核酸适配体分子为权利要求1
‑
17任一项所述核酸适配体分子，所述的荧光团分子具有下述式(I)所述的结构：电子供体部分
‑
D为
‑
NX1
‑
X2，X1选自氢、烷基、或改性烷基，X2选自氢、烷基、或改性烷基，X1，X2任选相互连接，与N原子一起形成脂杂环；共轭体系E为选自双键、叁键、芳香环、芳香杂环中的至少一种共轭连接而形成，其中所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、羟基、氨基、伯氨基、仲氨基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成脂环或脂杂环；X1，X2，独立地与共轭结构E连接成脂杂环；电子受体A部分如下式(I
‑1‑
a)的环状结构：
Ra独立地选自氢、卤原子、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基；R
b
独立地选自氢、卤原子、羟基、羧基、氨基、硝基、烷基、芳基、杂芳基、亲水性基团或改性烷基或者为双键与芳香环、芳香杂环中的至少一种共轭连接而形成的基团；各个Y1独立地选自
‑
O
‑
、
‑
S
‑
、
‑
(S＝O)
‑
和
‑
(NR
i
)
‑
，其中R
i
选自氢、氨基、烷基或改性烷基；各个Y2独立地选自＝O、＝S、＝S＝O和＝NR
i
，其中R
i
选自氢、烷基或改性烷基；各个Y3独立地选自＝O、＝S、＝S＝O和＝NR
i
，其中R
i
选自氢、烷基或改性烷基；或者，各个Y3独立地为＝C(R
e
)(CN)；其中R
e
选自氢、酯基、酰胺基、磺酸基、磺酰胺基、磺酸酯基；其中，所述“烷基”为C1‑
C
30
的直链或支链的烷基；优选地，为C1‑
C
10
直链或支链烷基；优选地，为C1‑
C7直链或支链烷基；优选地，为C1‑
C5直链或支链烷基；优选地，选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基，1
‑
甲基丁基、2
‑
甲基丁基、3
‑
甲基丁基、异戊基、1
‑
乙基丙基、新戊基、正己基、1
‑
甲基戊基、2
‑
甲基戊基、3
‑
甲基戊基、异己基、1,1
‑
二甲基丁基、2,2
‑
二甲基丁基、3,3
‑
二甲基丁基、1,2
‑
二甲基丁基、1,3
‑
二甲基丁基、2,3
‑
二甲基丁基、2
‑
乙基丁基、正庚基、2
‑
甲基己基、3
‑
甲基己基、2,2
‑
二甲基戊基、3,3
‑
二甲基戊基、2,3
‑
二甲基戊基、2,4
‑
二甲基戊基、3
...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨弋，左方婷，陈显军，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：