用于验证流式细胞术测量的方法和系统技术方案

公开了用于表征基于荧光的分析仪器进行的测量的可信性和再现性的验证方法和系统。的测量的可信性和再现性的验证方法和系统。的测量的可信性和再现性的验证方法和系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于验证流式细胞术测量的方法和系统
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年4月21日提交的美国临时申请号63/013,098的优先权权益，将其全部内容通过引用并入本文。


[0002]本公开文本涉及基于荧光的分析方法和系统，具体地涉及用于评价基于荧光的分析仪器进行的测量的可信性和再现性的验证方法。

技术介绍

[0003]基于荧光的细胞分析系统(如流式细胞术和荧光激活细胞分选术(FACS))是测量测试样品中各种细胞元件(如细胞表面受体和细胞内组分)的强大工具。在FACS方法中，使用抗体缀合的荧光色素(荧光染料)对样品进行染色，从而发出诸如细胞受体或其他细胞标记物、肽和核酸的元件的存在和量的信号。多种不同荧光色素的开发允许一次同时使用多于一种荧光色素，其中每种荧光色素具有独特的、可识别的发射光谱。由于它们的组合能力和多功能性，因此流式细胞术和FACS通常用于整个药物开发过程，例如用于免疫分型、受体表达或占用以及其他功能测定。
[0004]虽然功能强大，但由于各种原因，流式细胞术和FACS方法通常比其他分析方法验证起来更具挑战性。这些原因包括缺乏方案标准化、缺乏标准化参考材料以及使用复杂且灵敏的仪器装置。通常用于染色的单克隆抗体和多克隆抗体不是标准化的，并且在质量和性能上可能变化很大。因此，研究人员有责任仔细评估所使用的试剂按预期工作。然而，对于执行给定方法和仪器的验证几乎没有给研究人员指导。根据例如US FDA，验证被简单地定义为对方法用于预期应用的适合性的评价，并且建议验证测试过程必须确保测定满足预定标准并且可靠地执行并且适合其预期用途。FDA指南承认，没有通用验证规则是恰当的，并且未提供用于验证测定的具体指南。缺少用于验证的标准或公认的监管指南和参考材料是一个挑战，令人遗憾地是文献没有很好地解决。当样品中目的靶细胞或标记物被认为以非常低的浓度存在时，方法验证的挑战甚至更大。需要改进的验证方法来验证基于荧光的分析方法和系统的性能。

技术实现思路

[0005]本公开文本的各个方面包括一种用于验证基于荧光的分析仪器对测试样品中染色的靶细胞群体的测量的方法，所述方法包括：(a)对包含表达靶细胞标记物的靶细胞的参考样品的第一部分中的细胞进行负染色或已经进行负染色；(b)对所述参考样品的第二部分中的所述靶细胞进行正染色或已经进行正染色；(c)使所述参考样品第一部分通过所述仪器以获得指示所述参考样品第一部分中的靶细胞浓度的荧光测量值，并且使所述参考样品第二部分通过所述仪器以获得指示所述参考样品第二部分中的靶细胞浓度的荧光测量值；(d)基于(c)中获得的所述荧光测量值，制备包含多个稀释样品的稀释系列，每个稀释样
品具有标称浓度的所述靶细胞，每个标称细胞浓度大于由(a)中所述负染色的第一部分的荧光测量值指示的靶细胞浓度，其中每个稀释样品中的所述标称浓度不同于每个剩余稀释样品中的所述标称浓度；(e)使来自(d)的所述系列稀释样品通过所述仪器以获得一系列荧光测量值，所述系列荧光测量值包括每个稀释样品的荧光测量值；以及(f)对于每个稀释样品，比较来自(d)的所述标称细胞浓度和来自(e)的所述荧光测量值以定量在所述仪器中所述染色方法的性能。所述仪器可以是例如流式细胞仪。
[0006]在另一个方面，本公开文本提供了一种用于验证流式细胞仪对测试样品中染色的靶细胞群体的测量的方法，所述方法包括：(a)对包含表达靶细胞标记物的靶细胞的参考样品的第一部分中的细胞进行负染色或已经进行负染色；(b)对所述参考样品的第二部分中的所述靶细胞进行正染色或已经进行正染色；(c)使所述参考样品第一部分和所述参考样品第二部分都通过所述流式细胞仪，以获得指示所述参考样品第一部分和所述参考样品第二部分中的每一个中的靶细胞浓度的荧光测量值；(d)基于(c)中获得的所述荧光测量值，制备一系列稀释样品，每个稀释样品具有在整个所述稀释系列中系统地变化的标称浓度的所述靶细胞，其中至少一个稀释样品的所述标称细胞浓度大于由(a)中所述负染色的第一部分的荧光测量值指示的靶细胞浓度；(e)使来自(d)的所述系列稀释样品通过所述流式细胞仪以获得一系列荧光测量值，所述系列荧光测量值包括每个稀释样品的荧光测量值；以及(f)对于每个稀释样品，比较来自(d)的所述标称细胞浓度和来自(e)的所述荧光测量值以定量在所述流式细胞仪中所述染色方法的性能。
[0007]任何所公开的方法可以包括一个或多个任何以下特征。(f)中的所述比较可以包括例如对每个稀释样品的所述标称细胞浓度和所述荧光测量值之间的差异进行统计计算，以确定所述仪器和所述染色方法的线性、范围、准确度、精密度、检测限(LOD)和最低定量限(LLOQ)中的至少一个。确定LLOQ可以包括例如鉴定与用于精密度的预定标准和用于准确度的预定标准相关联的靶细胞浓度。(a)中对所述参考样品第一部分中的所述靶细胞进行负染色可以包括向所述参考样品第一部分中引入(i)荧光死细胞排除染料；(ii)缀合至荧光色素的非特异性抗体，例如作为同种型对照；和(iii)能够特异性结合所述靶细胞上的靶标记物(抗原)的未缀合至所述荧光色素的特异性抗体。缀合至所述荧光色素用于负染色的所述非特异性抗体可以包括缺乏特异性结合至细胞抗原的能力的抗体，例如像IgD、IgG、IgA、IgM或IgE。所述负染色的第一部分可以在没有细胞耗尽步骤的情况下制备。(b)中对所述参考样品第二部分中的所述靶细胞进行正染色可以包括向所述参考样品第二部分中引入(i)所述荧光死细胞排除染料(与用于负染色相同的染料)；和(ii)用于所述负染色的相同特异性抗体，但是不是未缀合至所述荧光色素，而是缀合至用于所述负染色的相同荧光色素(其中所述荧光色素缀合至所述非特异性抗体)。在任何方法中，用于染色的所述荧光死细胞排除染料可以选自核酸结合染料、碘化丙啶、DAPI、DRAQ7、7
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AAD、TO
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PRO
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3和胺活性染料。所使用的荧光色素可以选自已知的荧光色素，例如但不限于别藻蓝蛋白(APC)、APC C750、APC AF700、亮紫(BV)421、BV510、hilite 7(H7)BV605、BV650、PE CF594、异硫氰酸荧光素(FITC)、R
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藻红蛋白(PE或R
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PE)、PE
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Cy7(与菁染料Cy7偶联的PE)、APC
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Cy7(与菁染料Cy7偶联的APC)、APC
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H7(与Cy类似物Hilite 7(H7)偶联的APC)。所述靶细胞标记物可以选自例如作为T细胞标记物的CD3、CD4和CD8，作为B细胞标记物的CD19，作为红细胞标记物的CD235a，作为自然杀伤(NK)细胞标记物的CD56，作为单核细胞标记物的CD14以及作为粒细胞标记物
的CD66b。在一个方面，所述靶细胞群体是T细胞群体，并且所述靶细胞标记物是CD3。
[0008]所述方法可以进一步包括通过针对所述靶细胞的两种或更多种不同靶标记本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于验证基于荧光的分析仪器对测试样品中染色的靶细胞群体的测量的方法，所述方法包括：a.对包含表达靶细胞标记物的靶细胞的参考样品的第一部分中的细胞进行负染色或已经进行负染色；b.对所述参考样品的第二部分中的所述靶细胞进行正染色或已经进行正染色；c.使所述参考样品第一部分通过所述仪器以获得指示所述参考样品第一部分中的靶细胞浓度的荧光测量值，并且使所述参考样品第二部分通过所述仪器以获得指示所述参考样品第二部分中的靶细胞浓度的荧光测量值；d.基于(c)中获得的所述荧光测量值，制备包含多个稀释样品的稀释系列，每个稀释样品具有标称浓度的所述靶细胞，每个标称细胞浓度大于由(a)中所述负染色的第一部分的荧光测量值指示的靶细胞浓度，其中每个稀释样品中的所述标称浓度不同于每个剩余稀释样品中的所述标称浓度；e.使来自(d)的所述系列稀释样品通过所述仪器以获得一系列荧光测量值，所述系列荧光测量值包括每个稀释样品的荧光测量值；f.对于每个稀释样品，比较来自(d)的所述标称细胞浓度和来自(e)的所述荧光测量值以定量在所述仪器中所述染色方法的性能。2.根据权利要求1所述的方法，其中(f)中的比较包括对每个稀释样品的所述标称细胞浓度和所述荧光测量值之间的差异进行统计计算，以确定所述仪器和所述染色方法的线性、范围、准确度、精密度、检测限(LOD)和最低定量限(LLOQ)中的至少一个。3.根据权利要求1所述的方法，其中(a)中对所述参考样品第一部分中的所述靶细胞进行负染色包括向所述参考样品第一部分中引入(i)荧光死细胞排除染料、(ii)缀合至荧光色素的非特异性抗体、和(iii)能够特异性结合所述靶细胞上的靶标记物的特异性抗体。4.根据权利要求3所述的方法，其中(b)中对所述参考样品第二部分中的细胞中的所述靶细胞进行正染色包括向所述参考样品第二部分中引入(i)所述荧光死细胞排除染料、和(ii)缀合至权利要求3的荧光色素的权利要求3的特异性抗体。5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述荧光死细胞排除染料选自核酸结合染料、碘化丙啶、DAPI、DRAQ7、7
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3和胺活性染料。6.根据权利要求3所述的方法，其中所述荧光色素缀合的非特异性抗体包括缺乏特异性结合至细胞抗原的能力的抗体。7.根据权利要求7所述的方法，其中所述荧光色素缀合的非特异性抗体包括缀合至所述荧光色素的IgD、IgG、IgA、IgM或IgE中的任一种。8.根据权利要求3
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8中任一项所述的方法，其中所述荧光色素选自别藻蓝蛋白(APC)、APC C750、APC AF700、亮紫(BV)421、BV510、hilite 7(H7)BV605、BV650、PE CF594、异硫氰酸荧光素(FITC)、R
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藻红蛋白(PE或R
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Cy7(与菁染料Cy7偶联的PE)、APC
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Cy7(与菁染料Cy7偶联的APC)、APC
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H7(与Cy类似物Hilite 7(H7)偶联的APC)。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶细胞标记物选自作为T细胞标记物的CD3、作为B细胞标记物的CD19、作为红细胞标记物的CD235a、作为自然杀伤(NK)细胞标记物的CD56、作为单核细胞标记物的CD14以及作为粒细胞标记物的CD66b。10.根据权利要求1所述的方法，其中(f)中的所述计算由与所述仪器耦合的处理器执
行。11.根据权利要求2所述的方法，其中确定LLOQ包括鉴定与用于精密度的预定标准和用于准确度的预定标准相关联的靶细胞浓度。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述测试样品包含以不超过2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％或0.02％的浓度存在的所述靶细胞。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述稀释系列包含具有最高浓度的所述靶细胞的稀释样品，其中所述最高浓度为2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％或0.02％。14.根据权利要求4所述的方法，其中所述测试样品的所述负染色的第一部分在没有细胞耗尽步骤的情况下制备。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述基于荧光的仪器是流式细胞仪。16.一种用于验证流式细胞仪对测试样品中染色的靶细胞群体的测量的方法，所述方法包括：a.对包含表达靶细胞标记物的靶细胞的参考样品的第一部分中的细胞进行负染色或已经进行负染色；b.对所述参考样品的第二部分中的所述靶细胞进行正染色或已经进行正染色；c.使所述参考样品第一部分和所述参考样品第二部分都通过所述流式细胞仪，以获得指示所述参考样品第一部分和所述参考样品第二部分中的每一个中的靶细胞浓度的荧光测量值；d.基于(c)中获得的所述荧光测量值，制备一系列稀释样品，每个稀释样品具有在整个所述稀释系列中系统地变化的标称浓度的所述靶细胞，其中至少一个稀释样品的所述标称细胞浓度大于由(a)中所述负染色的第一部分的荧光测量值指示的靶细胞浓度；e.使来自(d)...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：基安迪斯医药知识产权有限公司，
类型：发明
国别省市：