一种磁性微球及DL-泛解酸拆分酶的固定化方法技术

本发明专利技术提供一种用于固定化DL

【技术实现步骤摘要】
一种磁性微球及DL
‑
泛解酸拆分酶的固定化方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种磁性微球和使用该磁性微球固定化DL
‑
泛解酸拆分酶的方法。

技术介绍

[0002]D
‑
泛解酸内酯是合成D
‑
泛酸系列产品重要的手型中间体。传统的D
‑
泛解酸内酯合成方法是以微生物酶法水解DL
‑
泛解酸内酯中的D
‑
泛解酸内酯，得到L
‑
泛解酸内酯和D
‑
泛解酸，酸酯分离后，D
‑
泛解酸再内酯化为D
‑
泛解酸内酯，L
‑
泛解酸内酯再化学消旋为DL
‑
泛解酸内酯重复上述步骤。
[0003]酶的固定化方法和载体对固定化酶的稳定性和催化活性具有重要影响，固定化酶载体提供的物理化学微环境是确保酶高效稳定的关键因素。作为固定化载体一要具备显著的反应性官能团，其能在恶劣的反应环境下发挥较高的稳定性；二要具有较小的空间位阻，可通过双功能试剂或多点共价连接与酶上存在的亲核基团相互作用来实现；三要具有惰性，能够与生物分子建立牢固的连接并防止其参与反应；四要具备一定的物理强度，高孔隙率，大比表面积等。
[0004]Fe3O4是一种常用的磁性纳米载体，具有生物相容性好，比表面积大，表面修饰性强、易于酶分子结合，快速高效回收等优点。尽管Fe3O4纳米粒子作为固定化载体具很多优势，但也存在一些限制因素，例如高表面能易发生聚集，高化学活性易受氧化，磁性和分散性易破坏等不足，因此有必要设计合适的载体，增强酶稳定性同时提升酶的催化效率，并尽可能减少产物抑制。
[0005]必须通过一些生物相容性化合物对Fe3O4纳米粒子进行功能化修饰，增强酶活性、稳定性和重复使用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种DL
‑
泛解酸拆分酶的固定化方法，本专利技术通过对Fe3O4磁性纳米粒子进行功能化修饰，得到一种用于固定化DL
‑
泛解酸拆分酶的载体，使用该载体可以大大提高DL
‑
泛解酸拆分酶的固定化效率和回收率，得到的固定化酶活性高、稳定性高、更易与底物结合，适合工业化生产。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种磁性微球，该磁性微球以磁性Fe3O4/聚甲基丙烯酸甲酯复合微球为内核，所述内核表面接枝聚乙烯醇，所述聚乙烯醇上连接有含巯基的基团。
[0009]根据本专利技术的一些实施方式，所述磁性微球的直径为200～250nm。
[0010]根据本专利技术的一些实施方式，所述聚乙烯醇的平均分子量是20000～100000，优选65000～75000。
[0011]根据本专利技术的一些实施方式，所述聚乙烯醇是聚乙烯醇
‑
7200。
[0012]本专利技术所述Fe3O4/聚甲基丙烯酸甲酯复合微球可以通过包括如下步骤的方法得
到：
[0013]将二价铁盐与三价铁盐混合后，加入油酸和氨水，60℃～90℃条件下反应得到Fe3O4磁性纳米粒子；
[0014]将所述Fe3O4磁性纳米粒子与甲基丙烯酸甲酯和二乙烯基苯混合，加入偶氮二异丁腈和聚乙烯醇水溶液乳化，搅拌反应，得到磁性Fe3O4/聚甲基丙烯酸甲酯复合微球。
[0015]在一些实施方式中，所述二价铁盐提供的Fe
2+
与三价铁盐提供的Fe
3+
的摩尔比为1:(1～2)，优选1:(1.2～1.8)更优选1:(1.4～1.6)。
[0016]在一些实施方式中，所述二价铁盐是七水硫酸亚铁或四水氯化亚铁。
[0017]在一些实施方式中，所述三价铁盐是六水三氯化铁或九水硫酸铁。
[0018]在一些实施方式中，所述氨水的浓度为20
‑
25wt％。
[0019]在一些实施方式中，所述聚乙烯醇水溶液的质量浓度为1.0～1.8％。
[0020]在一些实施方式中，所述聚乙烯醇是PVA17
‑
88。
[0021]在一些实施方式中，所述搅拌的转速是300～400r/min。
[0022]在一些实施方式中，所述反应的温度是45～65℃，优选50～60℃。
[0023]在一些实施方式中，所述反应的时间4
‑
6h。
[0024]根据本专利技术的一些实施方式，所述Fe3O4/聚甲基丙烯酸甲酯复合微球的制备包括如下步骤：
[0025](1)将六水三氯化铁和七水硫酸亚铁溶于去离子水中，加入油酸和25％氨水，60～85℃搅拌反应后磁分离，得到沉淀；
[0026](2)将得到的沉淀与油酸混合，70～90℃，150～250r/min搅拌反应后磁分离，得到Fe3O4磁性纳米粒子；
[0027](3)将步骤(2)得到的Fe3O4磁性纳米粒子与甲基丙烯酸甲酯和二乙烯基苯混合，再加入偶氮二异丁腈溶解后，加入聚乙烯醇水溶液，45～65℃、300
‑
400r/min搅拌反应4
‑
6h。
[0028]优选地，磁分离后，使用去离子水洗涤步骤(1)得到的沉淀和步骤(2)得到的Fe3O4磁性纳米粒子。
[0029]优选地，步骤(3)中，先45
‑
54℃搅拌反应50～70min后再升温至55～65℃继续搅拌反应3.5～4.5h。
[0030]第二方面，本专利技术提供第一方面所述的磁性微球的制备方法，包括如下步骤：
[0031](1)使Fe3O4/聚甲基丙烯酸甲酯复合微球在碱性条件下水解，进行酰氯化处理后，与含有聚乙烯醇的溶液混合反应，得到表面接枝聚乙烯醇的磁性微球；
[0032](2)将步骤(1)得到的表面连接聚乙烯醇的磁性微球与含巯基的试剂混合反应，得到聚乙烯醇上连接含巯基基团的磁性微球。
[0033]根据本专利技术的一些实施方式，步骤(1)中，所述水解的温度是40
‑
60℃优选45～55℃。
[0034]根据本专利技术的一些实施方式，步骤(1)中，所述水解的时间是12～24h优选14～20h。
[0035]根据本专利技术的优选实施方式，步骤(1)中，所述水解完成后使用稀盐酸调节pH至1～2，再进行酰氯化处理。
[0036]根据本专利技术的更优选实施方式，步骤(1)中，所述水解完成后使用稀盐酸调节pH至
1～2，反应10～30min后再进行酰氯化处理。
[0037]根据本专利技术的一些实施方式，步骤(1)中，使用含有氯化亚砜的试剂进行酰氯化处理。
[0038]根据本专利技术的一些实施方式，步骤(1)中，所述聚乙烯醇的溶液是聚乙烯醇的N,N
‑
二甲基甲酰胺溶液。
[0039]根据本专利技术的一些实施方式，步骤(1)中，所述反应的温度为4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磁性微球，以磁性Fe3O4/聚甲基丙烯酸甲酯复合微球为内核，所述内核表面接枝聚乙烯醇，所述聚乙烯醇上连接有含巯基的基团。2.根据权利要求1所述的磁性微球，其特征在于，所述磁性微球的直径为200～250nm；和/或所述聚乙烯醇的平均分子量为20000～100000，优选65000～75000，更优选地，所述聚乙烯醇是聚乙烯醇
‑
7200。3.一种磁性微球的制备方法，包括如下步骤：(1)使Fe3O4/聚甲基丙烯酸甲酯复合微球在碱性条件下水解，进行酰氯化处理后，与含有聚乙烯醇的溶液混合反应，得到表面接枝聚乙烯醇的磁性微球；(2)将步骤(1)得到的表面接枝聚乙烯醇的磁性微球与含巯基的试剂混合反应，得到聚乙烯醇上连接含巯基基团的磁性微球；优选地，步骤(1)中，所述水解完成后使用稀盐酸调节pH至1～2，再进行酰氯化处理。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水解的温度是40～60℃优选45～55℃，水解的时间是12～24h优选14～20h；和/或步骤(1)中，使用含有氯化亚砜的试剂进行酰氯化处理；和/或步骤(1)中，所述反应的温度为40～60℃，所述反应的时间为2～4h；和/或步骤(1)中，所述Fe3O4/聚甲基丙烯酸甲酯复合微球与聚乙烯醇的质量比为1：(5
‑
10)。5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述含巯基的试剂是巯基硅烷试剂，优选3
‑
巯丙基三乙氧基硅烷；和/或步骤(2)中，所述反应的温度是65～75℃，所述反应的时间是11～12h；和/或步骤(2)中，所述含巯基的试剂的用量为表面接枝聚乙烯醇的磁性微球上羟基物质量的3
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4倍。6.根据权利要求3～5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述反应在催化剂和有机溶剂中进行；优选地，所述催化剂是钛酸酯类催化剂，优选钛酸四烷基酯，更优选钛酸四丁酯；进一步优选地，所述有机溶剂是芳烃类有机溶剂，优选苯、甲苯、二甲苯。7.根据权利要求1～2任一项所述的磁性微球或权利要求3～6任一项所述的制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵根海，段小瑞，倪文枫，汪本助，徐帝，汪洪湖，
申请(专利权)人：安徽泰格生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：