一种婴儿血管瘤微肿瘤模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术属于生物医学领域，公开了一种婴儿血管瘤CD31+HemECs3D微肿瘤模型的构建方法及应用，包括：在无菌条件，用手术剪将血管瘤样本切碎，采用胶原酶A消化剪碎的组织；使用流式细胞仪从原代培养物中无菌分选CD31+细胞，在37℃含5％CO2的湿化环境中，对CD31+HemECs进行培养；将新鲜的猪主动脉浸泡在含有100U/ml青霉素和100g/ml链霉素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，置于冰上后立即转入实验室，进行猪主动脉去细胞化及血管特异性DAM特征；分析脱细胞猪主动脉细胞外基质水凝胶的特性；制备微图案阵列打印3D培养皿，形成CD31+HemEC微肿瘤；评估模型对IH一线治疗药物普萘洛尔的适用性。本发明专利技术为IH的机制探索和药物筛选提供更加稳定和高效的实验模型，有利于维持肿瘤的异质性，模拟体内瘤体组织。拟体内瘤体组织。拟体内瘤体组织。

【技术实现步骤摘要】
一种婴儿血管瘤微肿瘤模型的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于生物医学领域，尤其涉及一种婴儿血管瘤CD31+HemECs3D微肿瘤模型的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]目前，婴儿血管瘤(infantitle hemangioma,IH)是婴儿最常见的血管肿瘤，它是一种非先天性的良性肿瘤，在新生儿中的发病率约为4％
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5％.在过去的40年里，IH的发病率似乎显著增加，这可能与低出生体重和早产儿的增加有关。
[0003]IH的发生发展呈现了一个独特的生命周期，病变在出生时并不存在，一般在患儿3至7周开始，增殖至12个月，消退期开始于1岁左右，并持续3
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5年，大约50％～70％肿瘤有残余(毛细血管扩张、纤维脂肪组织、皮肤赘余、水肿、色素沉着或疤痕)。约10％
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15％的婴儿血管瘤可出现并发症，如肿瘤溃疡出血，也可导致美容问题，甚至会造成严重的毁容，可造成气道阻塞，发生严重并发症危及生命，也可引起视力障碍，在某些情况下还会发生充血性心力衰竭.我们之前研究证实IH对患儿及父母生活质量造成不同程度的影响。
[0004]IH发病机制尚不清楚。迄今为止，IH发病机制尚不清楚，病因假说较多，有假说提出可能是胚胎起源。据报道缺氧和血管紧张素被认为作为独立因素在血管瘤的发生发展中发挥重要作用，并且两者存在协同作用。目前，对于IH尚无统一安全有效的治疗方法。Leaute
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Labreze等人在2008年发表的一篇具有里程碑意义的论文中，发现2例患有IH的婴儿，其因心脏疾病服用心得安后，IH发生了消退。从那时起，普萘洛尔，一种非选择性β受体阻滞剂，已经成为IH治疗的一线药物。然而，目前普萘洛尔对于IH的作用机制尚未阐明，据报道其可能原因包括血管收缩、抑制血管生成、诱导凋亡、抑制一氧化氮生成和拮抗肾素－血管紧张素轴。普萘洛尔被认为是安全有效的，但是婴儿使用普萘洛尔的安全性并没有得到充分论证，可引发多种不良反应，导致治疗终止，造成IH复发。此外，目前接受治疗的第一批患者现在才进入青春期，普萘洛尔对婴幼儿神经认知的潜在的长期影响尚未可知。开发更安全有效的治疗方法和药物至关重要。
[0005]目前IH的研究尚无标准稳定的模型。IH没有稳定的细胞系用于相关研究，需要分离原代细胞，主要为IH衍生的内皮细胞和IH内皮祖细胞，这种二维细胞培养与体内组织结构和生理存在巨大的差异，且在裸鼠成瘤过程中常存在自发消退的情况，严重制约了IH发生发展相关机制的研究。
[0006]目前，许多医学研究仍依赖于传统的二维体外细胞培养或动物模型进行药物试验和发病机制探索。然而，这两种模式都有不可克服的缺点，虽然二维细胞培养系统来源于人体组织，但其与体内组织结构和生理存在巨大的差异，这些模型缺乏人体肿瘤的复杂微环境，包括细胞－细胞和细胞－细胞外基质相互作用，这是影响细胞命运的关键因素，会造成药物临床转化的失败。二维细胞也不能代表疾病的异质性，因为它们最初来自同质细胞系。而三维(3D)肿瘤细胞培养可以显著提高体外肿瘤细胞的活力、组织形态学、基因型稳定性、功能和药物代谢。它们的细胞聚集体被天然细胞外基质(natural extracellular matrix，
ECM)包裹，更好地复制了体内实体瘤的微环境。此外，动物模型不可避免地面临许多问题，如成本高、伦理问题、异质性等。
[0007]3D细胞培养方法包括悬滴法、基质包封培养、转培养瓶、超低附着板、摇摆悬浮培养技术、微孔网、微流控、磁悬浮和3D打印技术。近年，有学者通过共价或非共价涂覆碳水化合物、肽和蛋白质形成的微图案阵列在培养皿基底上形成确定形状和大小的图案排列，细胞被限制性地黏附在微图案上，细胞会通过细胞增殖和细胞－细胞黏附能力自发组装成具有3D多细胞结构的球体，从而能够培养可控大小和有序排列的3D多细胞球体，利于进行药物高通量筛选。聚二甲基硅氧烷(poly dimethylsiloxane，PDMS)吸附的蛋白质(作为生物墨水)通过微接触印刷技术在非附着培养皿上创建蛋白质特异性微阵列，已广泛用于细胞学、药物筛选和组织工程。纤维连接蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV和层粘连蛋白作为生物墨水常用于传统的微图案阵列。然而，单一的ECM蛋白成分不足以改善和调节特定细胞系、原代细胞或诱导多能干细胞衍生的分化细胞的活力和功能。最近几年，器官或组织去细胞化取得了最新进展，使得获得具有独特结构、组成以及生物和器官特异性ECM成为可能。与单一的ECM蛋白成分相比，例如广泛用于肝脏组织工程的胶原蛋白I，含有各种生物大分子的肝脏特异性ECM可以通过盘状结构域受体和跨膜蛋白多糖或者通过整合素与肿瘤细胞相互作用，调节与细胞增殖、迁移和分化相关的信号通路，从而影响细胞的生物学行为。
[0008]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0009](1)目前对于IH发病机制尚不清楚；
[0010](2)目前对于IH的研究尚无标准稳定的模型。

技术实现思路

[0011]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种婴儿血管瘤CD31+HemECs3D微肿瘤模型的构建方法及应用。
[0012]本专利技术是这样实现的，一种婴儿血管瘤CD31+HemECs3D微肿瘤模型的构建方法，所述婴儿血管瘤CD31+HemECs3D微肿瘤模型的构建方法包括：
[0013]步骤一，在无菌条件下，用手术剪将血管瘤样本切碎，采用胶原酶A消化剪碎的组织；
[0014]步骤二，使用流式细胞仪从原代培养物中无菌分选CD31+细胞，在37℃含5％CO2的湿化环境中，对CD31+HemECs进行培养；
[0015]步骤三，将新鲜的猪主动脉浸泡在含有100U/ml青霉素和100g/ml链霉素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并置于冰后立即转入实验室，采用Triton
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SDS
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Triton持续振荡法进行猪主动脉去细胞化，获得血管特异性DAM；
[0016]步骤四，冻干DAM并磨成粉末，制备DAM溶液；
[0017]步骤五，制备微图案阵列打印3D培养皿，培养CD31+HemEC微肿瘤；
[0018]步骤六，评估CD31+HemECs微肿瘤模型对IH一线治疗药物普萘洛尔的适用性。
[0019]进一步，所述步骤一是采用内皮细胞培养基培养CD31+HemECs原代细胞，所述内皮细胞培养基包含EBM
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2，添加20％胎牛血清、浓度为100单位/ml的青霉素和浓度为100μg/ml的链霉素。
[0020]进一步，所述步骤三中猪主动脉去细胞化的具体过程为：
[0021]首先，用蒸馏水在转速为100r/min的轨道振动筛上冲洗24h，裂解血细胞；
[0022]然后，浸入浓度为0.5％的TritonX
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100溶液中，持续振荡24h；用PBS洗涤2h后，将猪主动脉浸入0.25％SDS溶液中，连续振荡72h；为了去除残留的洗涤剂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种婴儿血管瘤CD31+HemECs3D微肿瘤模型的构建方法，其特征在于，所述婴儿血管瘤CD31+HemECs3D微肿瘤模型的构建方法包括：步骤一，在无菌条件下，用手术剪将血管瘤样本切碎，采用胶原酶A消化剪碎的组织；步骤二，使用流式细胞仪从原代培养物中无菌分选CD31+细胞，在37℃含5％CO2的湿化环境中，对CD31+HemECs进行培养；步骤三，将新鲜的猪主动脉浸泡在含有100U/ml青霉素和100g/ml链霉素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，置于冰上后立即转入实验室，采用Triton
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SDS
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Triton门静脉灌注法进行猪主动脉去细胞化及血管特异性DAM特征；步骤四，进行脱细胞猪主动脉细胞外基质水凝胶的特性分析；步骤五，制备微图案阵列打印3D培养皿，形成CD31+HemEC微肿瘤；步骤六，评估模型对IH一线治疗药物普萘洛尔的适用性。2.如权利要求1所述婴儿血管瘤CD31+HemECs3D微肿瘤模型的构建方法，其特征在于，所述步骤一是采用内皮细胞培养基培养原代细胞，所述内皮细胞培养基包含EBM
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2，添加20％胎牛血清、浓度为100单位/ml的青霉素和浓度为100μg/ml的链霉素。3.如权利要求1所述婴儿血管瘤CD31+HemECs3D微肿瘤模型的构建方法，其特征在于，所述步骤三中猪主动脉去细胞化的具体过程为：(1.1)用蒸馏水在转速为100r/min的轨道振动筛上冲洗24h，裂解血细胞；(1.2)浸入浓度为0.5％的TritonX
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100溶液中，持续振荡24h；用PBS洗涤2h后，将猪主动脉浸入0.25％SDS溶液中，连续振荡72h；为了去除残留的洗涤剂，将脱细胞化的猪主动脉用PBS振荡72h；(1.3)将脱细胞化的猪主动脉与新鲜猪主动脉用多聚甲醛固定，经石蜡包埋切片后，进行HE染色，评价脱细胞的程度。4.如权利要求1所述婴儿血管瘤CD31+HemECs3D微肿瘤模型的构建方法，其特征在于，所述步骤三中血管特异性DAM特征的具体过程为：(2.1)将获得的脱细胞血管保存在－20℃下以备进一步使用，所有步骤均在无菌环境下进行；(2.2)使用Wiley Mill将冻干的DAM磨成粉末，用浓度为10％的胃蛋白酶及0.01M HCl在室温下搅拌48h，获得血管脱细胞化ECM水凝胶；(2.3)加入0.1M NaOH将DAM溶液中和到pH值为7.2～7.4，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李亚楠，朱星龙，吉毅，包骥，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：