一种上皮来源肿瘤细胞纳米磁珠分选方法技术

一种上皮来源肿瘤细胞纳米磁珠分选方法，具体操作方式如下：(1)将carboxy l ic aci d活化的磁性纳米粒子加入1

【技术实现步骤摘要】
一种上皮来源肿瘤细胞纳米磁珠分选方法


[0001]本专利技术属于癌细胞分选
，特别涉及一种上皮来源肿瘤细胞纳米磁珠纳米分选方法。

技术介绍

[0002]类器官(organoids)是一种利用成体干细胞体外培养出的具有3D结构的细胞培养物，与对应的人类器官拥有高度相似的组织学特征，并能重现该器官的生理功能。肿瘤类器官(tumoroids)则是利用患者肿瘤组织体外培养的，与患者肿瘤的结构、生理等高度一致的“微肿瘤”。类器官可作为多种疾病的体外模型，在干细胞与发育、再生医学、疾病研究、药物开发和精准医疗等多个方面拥有广泛的应用前景。类器官模型可以复制肿瘤的组织复杂性与遗传异质性，与诸多临床前模型如2D细胞系、PDX模型等相比，类器官在成功率、维护难度、筛选难度上均表现出了良好的潜力，为从基因或蛋白水平研究类器官致癌或癌症相关机制的研究提供宝贵的模型。
[0003]类器官培养过程中，如何快速有效地分离获取到肿瘤细胞是非常重要的一步，且需要保持良好的细胞回收率及活性；目前此类研究较少。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种上皮来源肿瘤细胞纳米磁珠分选方法。
[0005]本专利技术具体操作方式如下：
[0006](1)制备功能磁珠：将carboxylic acid活化的磁性纳米粒子加入1
‑
乙基
ꢀ‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化；然后加入抗EpCam(上皮细胞粘附分子)单克隆抗体、抗Ki
‑
67单克隆抗体和/ 或抗泛CK单克隆抗体，于室温反应,反应完成后用PBS清洗，获得磁珠前驱体；加入牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性吸附位点，制成功能磁珠；
[0007](2)制备肿瘤细胞样本：通过Accuroid试剂盒的组织消化液对上皮的肿瘤组织样本进行消化，获得带有多种细胞类型的肿瘤细胞样本，将细胞密度稀释至106～107个/ml；
[0008](3)细胞分选：取步骤(1)获得的功能磁珠，加入步骤(2)稀释后的肿瘤细胞样本，使用磁力架进行分选，收集肿瘤细胞进行计数，使用流式细胞仪进行肿瘤细胞比例检测。
[0009]上述的步骤(1)中，所述carboxylic acid活化的磁性纳米粒子成分为氧化铁(II)和/或氧化铁(III)。
[0010]上述的步骤(1)中，所述carboxylic acid活化的磁性纳米粒子平均粒径为30nm。
[0011]上述的步骤(1)中，所述将磁性纳米粒子加入1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N
‑
羟基琥珀酰亚胺活化活化，活化时间为3～4h。
[0012]上述的步骤(1)中，1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N
‑
羟基琥珀酰亚胺、抗上皮细胞粘附分子单克隆抗体、抗Ki
‑
67单克隆抗体和抗泛CK 单克隆抗体的加入量按摩尔比EDC﹕NHS﹕(抗EpCam单克隆抗体、抗Ki
‑
67单克隆抗体和/或抗泛CK单克隆抗体)＝1﹕
1.5﹕1.5。
[0013]上述的步骤(1)中，抗EpCam单克隆抗体、抗Ki
‑
67单克隆抗体和/或抗泛CK单克隆抗体的以溶液的形式加入，每种溶液的浓度均为2mg/ml；其中每种成分的加入量与carboxylicacid活化的磁性纳米粒子摩尔比为1.2:1。
[0014]上述的步骤(1)中，加入抗EpCam单克隆抗体、抗Ki
‑
67单克隆抗体和/或抗泛CK单克隆抗体后，于室温反应时间为6～7h。
[0015]上述的步骤(1)中，用PBS清洗总共清洗三次。
[0016]上述的步骤(1)中，PBS为PBS缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl。
[0017]上述的步骤(1)中，用PBS清洗是将PBS完全浸没反应后的物料，清洗后分离出去PBS,计为一次。
[0018]上述的步骤(1)中，牛血清白蛋白的加入量为磁珠前驱体质量的1％。
[0019]上述的步骤(2)中，所述的消化为将肿瘤细胞从肿瘤组织中分离出来的过程。
[0020]本专利技术的优点在于：通过便捷的方法，制备了功能磁珠，将功能磁珠与肿瘤细胞样本进行一步法快速分选，较为精准地筛选肿瘤细胞使其能够快速应用于肿瘤类器官的培养。
具体实施方式
[0021]在本专利技术的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0022]本专利技术实施例中，carboxylicacid活化的磁性纳米粒子为Sigma
‑
Aldrich公司购买。
[0023]本专利技术实施例中，磁力架为市售强磁吸磁铁
[0024]本专利技术实施例中，流式细胞仪为赛默飞的AttuneNxT。
[0025]本专利技术实施例中，所述的消化为将肿瘤细胞从肿瘤组织中分离出来的过程。
[0026]本专利技术实施例中，PBS为PBS缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl。
[0027]本专利技术实施例中，用PBS清洗是将PBS完全浸没反应后的物料，清洗后分离出去PBS,计为一次。
[0028]本专利技术实施例中，carboxylicacid为羧酸。
[0029]实施例1
[0030]取500ul平均直径为30nm的carboxylicacid活化的磁性纳米粒子，向其加入EDC和NHS活化3h；然后加入抗EpCam单克隆抗体、抗Ki
‑
67单克隆抗体和抗泛CK单克隆抗体，于室温反应6h；反应完成后用PBS清洗三次；加入BSA封闭非特异性吸附位点；
[0031]carboxylicacid活化的磁性纳米粒子为氧化铁(II)；
[0032]抗EpCam单克隆抗体、抗Ki
‑
67单克隆抗体和抗泛CK单克隆抗体以溶液的形式加入，每种溶液的浓度均为2mg/ml；其中每种成分的加入量与carboxylicacid活化的磁性纳米粒子摩尔比为1.2:1；
[0033]按摩尔比EDC﹕NHS﹕(抗EpCam单克隆抗体、抗Ki
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67单克隆抗体+抗泛CK单克隆抗体)＝1﹕1.5﹕1.5；
[0034]通过消化获得肿瘤细胞样本，将细胞密度稀释至106个/ml；
[0035]BSA加入量为磁珠前驱体质量的1％；
[0036]取50ul功能磁珠，加入200ul肿瘤细胞，使用磁铁进行分选，收集肿瘤细胞进行计数，使用流式细胞仪进行肿瘤细胞比例检测；
[0037]收集的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种上皮来源肿瘤细胞纳米磁珠分选方法，其特征在于具体操作方式如下：(1)制备功能磁珠：将carboxylic acid活化的磁性纳米粒子加入1
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乙基
‑3‑
(3
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N
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羟基琥珀酰亚胺活化；然后加入抗EpCam单克隆抗体、抗Ki
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67单克隆抗体和/或抗泛CK单克隆抗体，于室温反应,反应完成后用PBS清洗，获得磁珠前驱体；加入牛血清白蛋白封闭非特异性吸附位点，制成功能磁珠；(2)制备肿瘤细胞样本：通过Accuroid试剂盒的组织消化液对上皮的肿瘤组织样本进行消化，获得带有多种细胞类型的肿瘤细胞样本，将细胞密度稀释至106～107个/ml；(3)细胞分选：取步骤(1)获得的功能磁珠，加入步骤(2)稀释后的肿瘤细胞样本，使用磁力架进行分选，收集肿瘤细胞进行计数，使用流式细胞仪进行肿瘤细胞比例检测。2.根据权利要求1所述的上皮来源肿瘤细胞纳米磁珠分选方法，其特征在于步骤(1)中，所述carboxylic acid活化的磁性纳米粒子成分为氧化铁(II)和/或氧化铁(III)。3.根据权利要求1所述的上皮来源肿瘤细胞纳米磁珠分选方法，其特征在于步骤(1)中，所述carboxylic acid活化的磁性纳米粒子平均粒径为30nm。4.根据权利要求1所述的上皮来源肿瘤细胞纳米磁珠分选方法，其特征在于步骤(1)中，所述将磁性纳米粒子加入1
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乙基
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(3
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N
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羟基琥珀酰亚胺活化活...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰坚强，朱宇，邹欢，徐丛，蓝婧婷，黄敏，
申请(专利权)人：创芯国际生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：