酵母NDI1基因及表达产物在制备治疗线粒体复合体Ⅰ缺陷的阿尔茨海默病药物上的应用制造技术

酵母NDI1基因及表达产物在制备治疗线粒体复合体Ⅰ缺陷的阿尔茨海默病药物上的应用，通过建立的Aβ诱导阿尔茨海默病细胞模型，确认酵母NDI1基因表达产物酵母复合体I(酵母NDI1蛋白)对人复合体I各方面功能异常和细胞病理的好转作用；并且通过建立的Aβ脑内注射阿尔茨海默病小鼠模型，确认脑内立体定位注射重组腺相关病毒AAV

【技术实现步骤摘要】
酵母NDI1基因及表达产物在制备治疗线粒体复合体Ⅰ缺陷的阿尔茨海默病药物上的应用


[0001]本专利技术涉及基因治疗
，具体涉及酵母NDI1基因及表达产物在制备治疗线粒体复合体Ⅰ缺陷的阿尔茨海默病药物上的应用。

技术介绍

[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种年龄相关的神经退行性疾病，其病理特征为β淀粉样蛋白(β
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amyloid，Aβ)沉积形成的神经细胞外斑块和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内纤维缠结，伴有神经炎症、线粒体异常、突触功能缺失及神经元丢失。AD是老年痴呆的最主要类型，65岁及以上人群AD患病率约为4
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8％，85岁以上则高达20
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30％。其临床表现为进行性记忆减退和认知功能减退，部分患者伴有精神行为异常，晚期个体丧失生活自理能力，家庭和社会负担沉重。2018年世界阿尔茨海默病报告指出，2018年全球痴呆费用高达1万亿美元，预计2030年全球痴呆费用将升至2万亿美元。迄今人们对AD发病机制的理解尚不完全，且缺乏有效治疗药物，AD已成为全球公众健康重大问题。
[0003]根据有无家族史，AD可分为家族性AD和散发性AD。以发病年龄65岁为界，AD可分为早发性AD和晚发性AD。晚发散发性AD是AD的最主要类型，约占全部AD病例的95％，而家族性AD发病较早，约半数家族性AD患者携带淀粉样前体蛋白(APP)、早老素1(PS1)或早老素2(PS2)基因突变而呈常染色体显性遗传。目前AD发病机制的主流假说——淀粉样蛋白级联假说认为，Aβ生成清除的失衡导致Aβ异常聚集和寡聚体化，触发级联反应导致AD发生。但淀粉样蛋白级联假说并不能完全解释以下现象：
①
Aβ斑块负荷与认知损害程度的相关性很差；
②
脑内存在大量Aβ沉积的个体可以长期无临床症状及神经退行性病变的生化特征；
③
迄今为止完成的针对Aβ的免疫治疗临床试验均宣告失败。因此有学者们认为，AD不单是Aβ升高的下游结果，而是多因素导致的疾病；对于散发性AD，Aβ沉积可能是其它病理机制所致的继发性改变；线粒体功能异常可能是导致AD中晚发散发性类型的原发性病理因素。
[0004]近年来，基于AD患者脑组织及血小板、转基因小鼠、转基因细胞系及Aβ处理的哺乳动物细胞的研究发现，线粒体异常为AD病理改变的早期事件，提出了AD病理机制的线粒体级联假说。线粒体级联假说认为，一方面，遗传因素和衰老引起的线粒体功能障碍及伴随的氧化损伤，可导致Aβ的产生和沉积、突触变性和神经元丢失；另一方面，线粒体内APP和Aβ的沉积进一步损伤线粒体的结构和功能。具体地说，线粒体与APP/Aβ相互作用：一方面，病变线粒体是导致AD病理改变的原因。病变线粒体可通过多种途径影响APP的代谢，线粒体氧化磷酸化功能障碍产生的活性氧自由基，上调APP、β分泌酶、PS1的表达，促进APP通过β分泌酶途径的降解和Aβ的沉积。病变线粒体内NAD
+
/NADH比值降低，不利于APP通过α分泌酶途径的降解，β分泌酶途径的降解则相对增加，产生过多的Aβ。另一方面，AD病理改变又导致线粒体的进一步病变，形成恶性循环。
[0005]线粒体功能障碍是AD的一个早期特征，并且在其发病机制中起着重要作用。在Aβ沉积和tau缠结开始形成之前，AD患者线粒体功能已被证明受到影响，包括葡萄糖代谢减
弱、线粒体酶失活和活性氧自由基(ROS)产生增加。在AD早期，线粒体动力学失调，糖酵解过程受到干扰，电子传递链蛋白复合体的酶活性受损，抗氧化酶活性下降。线粒体DNA(mtDNA)突变在AD线粒体功能障碍中起重要作用，与AD的发病相关。
[0006]在AD中，线粒体复合体的功能受到的损害，发生在疾病的超早期阶段。有研究组检测了一种新的三重转基因(PR5/APP/PS2)AD小鼠模型的线粒体功能。除线粒体功能缺陷外，该模型兼具AD的两个典型组织病理学特征(淀粉样斑块和神经纤维缠结)。利用定量蛋白质组学和质谱技术，他们发现24个蛋白质大量失控，其中三分之一是线粒体蛋白质，主要与氧化磷酸化系统的复合体相关。Tau和Aβ的病理协同作用于线粒体，促进了氧化磷酸化系统缺陷，线粒体呼吸能力和ATP产生的急剧下降可能最终导致AD特征性的突触丢失和神经元死亡。该研究结果提示，除针对Aβ和(或)tau病理进行治疗外，通过稳定或恢复线粒体复合体功能，在线粒体水平保护细胞，这种策略在治疗或预防AD方面是有前途的。
[0007]哺乳动物线粒体复合体Ⅰ(即NADH脱氢酶复合体)由45个亚基构成，包括线粒体DNA编码的7个亚基和细胞核DNA编码的38个亚基。与其他复合体相比，复合体Ⅰ在线粒体电子传递过程中的作用尤为重要，此外复合体Ⅰ还参与氧化应激、细胞凋亡、线粒体自噬等。线粒体复合体Ⅰ功能缺陷可导致神经、肌肉等系统的疾病，包括线粒体肌病、帕金森病、AD、Leber氏视神经病等。据研究报道，老化的大脑中存在明显的线粒体功能障碍，其中呼吸链复合体Ⅰ的损伤最为突出。人类脑组织蛋白谱定量分析表明，晚发性AD患者个体的脑内线粒体复合体I有多达12种不同亚基的表达显著降低，但复合体II、III、IV、V的表达未见显著改变。上述研究提示，修复线粒体复合体Ⅰ的功能可能对AD的治疗具有重要意义。
[0008]AD患者的标准治疗药物包括胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐、卡巴拉汀和加兰他敏)和NMDA受体阻滞剂(美金刚)。前者阻断胆碱能神经元的神经递质ACh的降解，后者减弱过量的谷氨酸神经递质活性。这两类药物只能改善认知/记忆症状，并不能阻止病情的发展，更不能治愈。在针对Aβ的临床治疗试验中，Aβ抗体等治疗无法切实地改变疾病的进程，在某些情况下，干预似乎加速了认知能力的下降，或者产生了毒副作用。基于观察到神经纤维缠结与疾病的区域和症状进展密切相关，tau靶向治疗近年来受到越来越多的关注。生物能和线粒体功能障碍导致AD的事实提示采用生物能和线粒体医学方法治疗是合理的。生物能药物通常包括维生素、辅因子等，其中一些已经进行AD临床试验，但效果有限。一些靶向线粒体功能的小分子调节剂已经开展前期研究或临床试验用于治疗AD，包括线粒体分裂抑制剂(Drp1)、线粒体自噬激活剂(PINK1)、mPTP阻遏剂(CypD)、促神经类固醇生成剂、抗氧化剂等。到目前为止，针对线粒体功能障碍的治疗策略主要集中在氧化应激和细胞凋亡。然而，在AD患者中进行抗氧化剂的临床试验并没有产生明确的益处。将抗氧化剂特异性地定位于线粒体有可能改善效果，例如采用线粒体靶向抗氧化剂MitoQ。针对细胞凋亡，最近采用线粒体mPTP阻遏剂可能有一定作用。
[0009]根据近年Clinicaltrials.gov数据库，大多数AD临床治疗试验都集中在Aβ(438项试验)，其他分别集中在tau(205项试验)、APOE(81项试验)和线粒体(11项试验)。针对AD传统神经病理的临床治疗试验继续占据主导地位，而涉及线粒体的研究相比之下落后。考虑到AD的多因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.酵母NDI1基因及表达产物在制备治疗线粒体复合体Ⅰ缺陷的阿尔茨海默病药物上的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的酵母NDI1基因的表达产物为酵母NDI1蛋白。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的年龄相关的神经退行性疾病为阿尔茨海默病。4.一种具有权利要求1所述的酵母NDI1基因的重组病毒AAV9
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NDI1在制备治疗线粒体复合体Ⅰ缺陷的阿尔茨海默病的基因治疗药物上的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的重组病毒AAV9
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NDI1通过以下步骤制备：(1)采用限制酶切、连接法，将NDI1基因插入质粒pAAV<...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红智，沈露茜，顾海华，陈卓，申钰琪，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：