具有提高的治疗USH1B的安全性的双AAV-MYO7A载体制造技术

公开了用于治疗哺乳动物眼部疾病，并且特别是与厄舍综合征IB(USH1B)相关的视网膜并发症的组合物和方法。还公开了用于治疗哺乳动物内耳疾病，并且特别是与厄舍综合征IB(USH1B)相关的耳毛细胞并发症的组合物和方法。本公开内容提供了改进的基于AAV的双载体系统，其促进全长蛋白质的表达，所述全长蛋白质的编码序列超过单个AAV载体的多核苷酸包装容量。本文中描述了经修饰杂交体双载体系统，其通过改变分裂点(例如，从外显子23与24之间改变至外显子21与22之间)将MY07A尾部结构域的编码序列从前半载体转移到后半载体，从而消除截短MY07A蛋白的产生。本文进一步描述了改进的、密码子修饰的杂交体和重叠载体系统，其中去除了非编码序列中的推定的终止密码子和残留序列。非编码序列中的推定的终止密码子和残留序列。非编码序列中的推定的终止密码子和残留序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有提高的治疗USH1B的安全性的双AAV
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MYO7A载体
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2020年4月1日提交的美国临时申请No.63/003,774的申请日的权益，其全部内容通过引用并入。
[0003]非联邦支持
[0004]本专利技术全部或部分由在来自抗击失明基金会的赠款奖励编号TA
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GT
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0419
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9774
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UFL
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GH下和在来自Atsena Therapeutics，Inc的协议编号AGR00018211下的经费完成。

技术介绍

[0005]重组AAV已成为治疗视网膜疾病的可用的基因递送载剂。然而，AAV的一个限制是其相对小的DNA包装容量——大约4.7千碱基(KB)。因此，标准的AAV载体系统不适用于处理其中大基因被突变或在其他情况下功能失调的疾病，例如厄舍综合征(Usher syndrome)。需要一种解决方案以便将大基因包装到AAV载体系统中并将基因治疗治疗安全地递送至患者。
[0006]专利技术概述
[0007]本公开内容一般性地涉及分子生物学和病毒学领域，并且特别地涉及基因递送载剂的开发。公开了改进的rAAV双载体和多核苷酸载体系统，以及组合物，其可用于将多种核酸区段(包括编码治疗性蛋白质、多肽、肽、反义寡核苷酸或核酶构建体的那些)递送至所选宿主细胞以用于多种基因治疗方案。还公开了包含任何的这些rAAV双载体和多核苷酸载体系统的重组病毒颗粒、分离的宿主细胞和药物组合物。还提供了用于制备和在多种基于病毒的基因治疗(并且特别是用于治疗和/或改善肌球蛋白VII缺陷的症状，在不受限制的情况下，包括治疗人厄舍综合征IB型)中使用本文中公开的改进的rAAV双载体系统的方法。本文中还提供了治疗或改善疾病或病状的方法，其涉及施用编码MYO7A蛋白并导致与先前可用的载体系统相比细胞毒性降低的rAAV双载体系统。在一些方面中，提供了施用载体系统的方法，通过该方法使截短的MYO7A蛋白的量和/或相关的细胞毒性最小化。在一些实施方案中，治疗性多肽不是肌球蛋白多肽。
[0008]在多个方面中，本文中提供的治疗方法和药物组合物旨在用于向对象(例如人或动物对象)的一只或两只眼施用。在另外的多个方面中，本文中提供的治疗方法和药物组合物旨在用于向对象(例如人或动物对象)的一只或两只耳施用。
[0009]本公开内容提供了用于疾病(例如厄舍综合征)的基因治疗的材料和方法。厄舍综合征(包括I型(例如，USH1B)、II型和III型)是一种导致感觉病损的病症，特别是在视觉、听觉和前庭系统中。伴随厄舍综合征的感觉损失甚至可在出生时出现，并且随着年龄的增长逐渐恶化。
[0010]厄舍综合征USH1B最常见的形式是由肌球蛋白VIIa基因突变引起的严重的常染色体隐性、聋盲(deaf
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blindness)的病症。患者由于人肌球蛋白VII蛋白(MYO7A)的表达不足和/或导致蛋白质功能失调(protein malfunction)的基因突变而天生耳聋。失明是从在生命的第一个十年中开始的进行性视网膜变性引起的。MYO7A蛋白在光感受器
(photoreceptor)和视网膜色素上皮(RPE)中表达，并涉及通过光感受器纤毛和RPE黑素小体的运动来参与视蛋白转运。研究表明，光感受器(PR)可以是疾病的初始部位，并且其在人中光感受器外部区段周围的黏附带结构中的缺陷可导致在USH1B患者中所见的视网膜变性(Sahly，et al.，2012)。然而，MYO7A蛋白的编码区的长度为6534或6648个核苷酸(取决于同种型)，使得传统的AAV载体系统不适合用于USH1B的基因治疗。
[0011]虽然目前没有适合用于这种病症的治疗，但是基因治疗为恢复/维持视觉、听觉和前庭系统中的功能提供了希望。此前，Allocca et al.(2008)发表的结果表明AAV5血清型载体能够包装尺寸高至8.9KB的基因组，并且这些载体当在体内递送时表达全长蛋白质。在Allocca et al.(2008)中，作者从含有驱动hMYO7A的CMV启动子的AAV5载体中表达了全长MYO7A蛋白。随后的研究证实了这些“超大”AAV5载体确实驱动了全长蛋白表达，然而发现每个载体衣壳的遗传含量仅限于～5KB的DNA，而不是Allocca et al.(2008)最初报道的8.7KB(Lai et al.，2010；Dong et al.，2010；Wu et al.，2010)。这些载体衣壳被表明包含截短的载体基因组的“异质混合物”(例如，基因的5
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端、基因的3
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端、或具有内部序列缺失的二者的混合物)。另外，当与标准尺寸(＜5KB)的匹配报道载体相比，这些超大/异质载体表现出差的包装效率(例如，导致低载体滴度)和低的转导效率(Wu et al.，2010)。
[0012]使用在Lai et al.(2010)、Dong et al.(2010)和Wu et al.(2010)中所述的“异质”系统，尽管观察到差的包装效率，但包含MYO7A转基因的一部分的载体仍被包装，并且在USH1B的shaker
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1小鼠模型中证明了概念验证阶段(proof
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of
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concept)的结果。用异质AAV
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hMYO7A载体获得的治疗结果与先前使用基于慢病毒的hMYO7A载体的基因替代结果相当(Hashimoto et al.，2007)。这种慢病毒MYO7A载体正在由Oxford BioMedica与Sanofi
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Aventis合作开发以用于USH1B的I/II期临床试验，其以的名称进行销售。慢病毒被认为是一种载体平台，其不能良好地适用于感染有丝分裂后(例如，非分裂)的细胞。此外，虽然该载体适合用于转导RPE，但是许多研究表明其在转导成人光感受器方面无效。因为光感受器(PR)可以是疾病的初始部位(Sahly，et al.，2012)，因此对RPE细胞的专属靶向可能不会带来完整或有效的治疗，尽管其在人临床试验中仍有待观察。
[0013]由于在LCA2/RPE65的AAV基因治疗试验中具有优异的安全性谱和令人鼓舞的效力报告，在创建用于治疗USH1B患者的基于AAV的系统是持续令人感兴趣的。本专利技术人先前已表征用于治疗USH1B患者的AAV双载体平台，其也在本文中进行了描述。通过本专利技术人设计的原始双载体系统(例如，“第一代”双载体系统)已成功表明，由该系统产生的mRNA相对于其通过前和后载体对的正确同源重组所预测的而言是100％准确的，使得它们可用作基因治疗递送载体系统。这些载体在美国专利公开No.2019/0153050和2014/0256802中描述，其各自通过引用整体并入本文。
[0014]本公开内容至少部分地基于以下观察结果：一些先前的双载体平台导致截短的MYO7A蛋白的产生，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.多核苷酸载体系统，其包含：i)第一AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的启动子，启动子之后是编码肌球蛋白多肽的N端部分的部分编码序列，以及ii)第二AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的编码所述肌球蛋白多肽的C端部分的部分编码序列，其中编码所述第一AAV载体和所述第二AAV载体中的多肽序列的多核苷酸序列包含有重叠的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：63、90或66具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列；并且所述第二AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：77或80具有至少约80％至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。2.多核苷酸载体系统，其包含：i)第一AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的启动子，启动子之后是编码肌球蛋白多肽的N端部分的部分编码序列，以及ii)第二AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的编码所述肌球蛋白多肽的C端部分的部分编码序列，其中编码所述第一AAV载体和所述第二AAV载体中的多肽序列的多核苷酸序列包含有重叠的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV载体多核苷酸包含选自SEQ ID NO：63、90和66的核苷酸序列；并且所述第二AAV载体多核苷酸包含选自SEQ ID NO：77和80的核苷酸序列。3.多核苷酸载体系统，其包含：i)第一AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的启动子，启动子之后是编码肌球蛋白多肽的N端部分的部分编码序列，以及ii)第二AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的编码所述肌球蛋白多肽的C端部分的部分编码序列，其中编码所述第一AAV载体和所述第二AAV载体中的多肽序列的多核苷酸序列包含有重叠的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV载体多核苷酸编码与SEQ ID NO：62、91或65的氨基酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列；并且所述第二AAV载体多核苷酸编码与SEQ ID NO：78或81的氨基酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。4.权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含SEQ ID NO：63的核苷酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含SEQ ID NO：77的核苷酸序列。5.权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含SEQ ID NO：63的核苷酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含SEQ ID NO：80的核
苷酸序列。6.权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含SEQ ID NO：90的核苷酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含SEQ ID NO：77的核苷酸序列。7.权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含SEQ ID NO：90的核苷酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含SEQ ID NO：80的核苷酸序列。8.权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含SEQ ID NO：66的核苷酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含SEQ ID NO：77的核苷酸序列。9.权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含SEQ ID NO：66的核苷酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含SEQ ID NO：80的核苷酸序列。10.权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：50的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：51的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。11.权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：50的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：38的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。12.权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：38的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。13.权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：50的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。14.权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：51的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。15.权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸
包含与SEQ ID NO：36的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。16.权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：36的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：38的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。17.权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：36的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：51的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。18.权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：37的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：38的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。19.权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：37的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。20.权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：37的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：51的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。21.多核苷酸载体系统，其包含：i)第一AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的启动子，启动子之后是编码治疗性多肽的N端部分的部分编码序列，以及ii)第二AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的编码所述治疗性多肽的C端部分的部分编码序列，其中编码所述第一AAV载体和所述第二AAV载体中的多肽序列的多核苷酸序列包含有重叠的多核苷酸序列，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含与选自SEQ ID NO：39和52至59中任一个的序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序
列。22.权利要求1至21中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列为约1至50个核苷酸、约100至500个核苷酸、约100至200个核苷酸、约200至300个核苷酸、约300至400个核苷酸、约400至500个核苷酸、约500至600个核苷酸、约600至700个核苷酸、约700至800个核苷酸、约800至900个核苷酸、约900至1000个核苷酸、约1000至1100个核苷酸、约1100至1200个核苷酸、或约1200至1300个核苷酸。23.权利要求1至22中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含与选自SEQ ID NO：39和52至59中任一个的序列具有至少约85％、90％、95％或98％同一性的核苷酸序列。24.权利要求1至23中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含选自SEQ ID NO：39和52至59中任一个的核苷酸序列。25.权利要求1至24中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：39。26.权利要求1至24中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：52。27.权利要求1至24中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：53。28.权利要求1至24中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：54。29.权利要求1至24中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：55。30.权利要求1至24中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：56。31.权利要求1至24中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：57。32.权利要求1至24中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：58。33.权利要求1至24中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：59。34.权利要求1至33中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中在所述第一AAV载体多核苷酸的每一端的所述反向末端重复之间的长度为约4615个核苷酸(nt)或更少。35.权利要求1至34中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中在所述第二AAV载体多核苷酸的每一端的所述反向末端重复之间的长度为约4800nt或更少。36.权利要求1至35中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中在所述第二AAV载体多核苷酸的每一端的所述反向末端重复之间的长度为约4560nt。37.多核苷酸载体系统，其包含：i)第一AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的启动子，启动子之后是编码治疗性多肽的N端部分的部分编码序列，以及
ii)第二AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的编码所述治疗性多肽的C端部分的部分编码序列，其中编码所述第一AAV载体和所述第二AAV载体中的多肽序列的多核苷酸序列包含有重叠的多核苷酸序列，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：79和82至89中任一个的序列。38.权利要求37所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列为约1至50个核苷酸、约100至500个核苷酸、约100至200个核苷酸、约200至300个核苷酸、约300至400个核苷酸、约400至500个核苷酸、约500至600个核苷酸、约600至700个核苷酸、约700至800个核苷酸、约800至900个核苷酸、约900至1000个核苷酸、约1000至1100个核苷酸、约1100至1200个核苷酸或约1200至1300个核苷酸。39.权利要求1至38中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：79的序列。40.权利要求1至38中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：82的序列。41.权利要求1至38中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：83的序列。42.权利要求1至38中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：84的序列。43.权利要求1至38中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：85的序列。44.权利要求1至38中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：86的序列。45.权利要求1至38中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：87的序列。46.权利要求1至38中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：88的序列。47.权利要求1至38中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述有重叠的多核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：89的序列。48.权利要求21至47中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述治疗性多肽不是肌球蛋白多肽。49.权利要求21至48中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述治疗性多肽：(i)是肌球蛋白；(ii)是harmonin、钙黏着蛋白23、原钙黏着蛋白15或usherin；(iii)由长度为约5Kb至约10Kb、约6Kb至约9Kb或约7Kb至约8Kb的基因编码；和/或(iv)由选自以下的基因编码：ABCA4、CEP290、EYS、RP1、ALMS1、CDH23、PCDH15、USH1C、USH1G、USH2A(usherin)、DNFB31、DMD、CFTR、GDE、DYSF、F8和DFNB2。50.多核苷酸载体系统，其包含：i)第一AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的启动子，启动子之后是编码肌球蛋白多肽的N端部分的部分编码序列，
以及ii)第二AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的编码所述肌球蛋白多肽的C端部分的部分编码序列，其中编码所述第一AAV载体和所述第二AAV载体中的多肽序列的多核苷酸序列包含有重叠的多核苷酸序列，并且其中所述肌球蛋白多肽的C端部分包含所述肌球蛋白多肽的单α螺旋(SAH)结构域。51.多核苷酸载体系统，其包含：i)第一AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的启动子，启动子之后是编码肌球蛋白多肽的N端部分的部分编码序列，以及ii)第二AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的编码所述肌球蛋白多肽的C端部分的部分编码序列，其中编码所述第一AAV载体和所述第二AAV载体中的多肽序列的多核苷酸序列包含有重叠的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：36的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且所述第二AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：38的核苷酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。52.权利要求50或权利要求51所述的多核苷酸载体系统，其中所述肌球蛋白多肽是人肌球蛋白VIIa多肽、人肌球蛋白VIIb多肽、肌球蛋白VIIa同种型2、或者另一种肌球蛋白同种型或其功能片段。53.权利要求52所述的多核苷酸载体系统，其中所述人肌球蛋白VIIa多肽包含与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列或其功能片段。54.权利要求1至20中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述肌球蛋白多肽是人肌球蛋白VIIa多肽、肌球蛋白VIIa同种型2、或者另一种肌球蛋白同种型或其功能片段。55.权利要求54所述的多核苷酸载体系统，其中所述人肌球蛋白VIIa多肽包含与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列或其功能片段。56.多核苷酸载体系统，其包含：i)第一AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的启动子，启动子之后是编码肌球蛋白多肽的N端部分的部分编码序列，随后是剪接供体位点和第一内含子，以及ii)第二AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的第二内含子和针对所述第一内含子的剪接接受体位点，其中所述第一内含子和所述第二内含子的核苷酸序列包含有重叠的多核苷酸序列，并且其中所述第一内含子序列和/或所述第二内含子序列包含与SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：70具有至少约80％至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸
序列。57.权利要求56所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一内含子序列包含SEQ ID NO：69的核苷酸序列。58.权利要求56所述的多核苷酸载体系统，其中所述第一内含子序列包含SEQ ID NO：70的核苷酸序列。59.权利要求56至58中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第二内含子序列包含SEQ ID NO：69的核苷酸序列。60.权利要求56至58中任一项所述的多核苷酸载体系统，其中所述第二内含子序列包含SEQ ID NO：70的核苷酸序列。61.多核苷酸载体系统，其包含：i)第一AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的启动子，启动子之后是编码治疗性多肽的N端部分的部分编码序列，随后是剪接供体位点和第一内含子，以及ii)第二AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的第二内含子和针对所述第一内含子的剪接接受体位点，其中所述第一内含子和所述第二内含子的核苷酸序列包含有重叠的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV载体多核苷酸序列与所述第二AAV载体多核苷酸序列之间的分裂点在编码所述治疗性蛋白质的基因的两个外显子之间。62.权利要求61所述的多核苷酸载体系统，其中所述治疗性多肽：(i)是肌球蛋白VIIa、肌球蛋白VIIa的同种型、肌球蛋白VIIa同种型2、肌球蛋白VIIb、和肌球蛋白VIIb的同种型、harmonin、钙黏着蛋白23、原钙黏着蛋白15或usherin；(ii)由长度为约5Kb至约10Kb、约6Kb至约9Kb或约7Kb至约8Kb的基因编码；和/或者(iii)由选自以下的基因编码：ABCA4、CEP290、EYS、RP1、ALMS1、CDH23、PCDH15、USH1C、USH1G、USH2A(usherin)、DNFB31、DMD、CFTR、GDE、DYSF、F8和DFNB2。63.权利要求61或权利要求62所述的多核苷酸载体系统，其中编码所述治疗性蛋白质的所述基因是人MYO7A(hMYO7A)，并且其中所述分裂点：(i)在所述hMYO7A基因的外显子21与外显子22之间；(ii)在所述hMYO7A基因的外显子22与外显子23之间；和/或(iii)不在所述hMYO7A基因的外显子23与外显子24之间。64.多核苷酸载体系统，其包含：i)第一AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的启动子，启动子之后是编码肌球蛋白多肽的N端部分的部分编码序列，随后是剪接供体位点和第一内含子，以及ii)第二AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的第二内含子和针对所述第一内含子的剪接接受体位点，其中所述第一内含子和所述第二内含子的核苷酸序列包含有重叠的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：73具有至少约80％、至少85％、至少
90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列；并且所述第二AAV载体多核苷酸包含与SEQ ID NO：75具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。65.多核苷酸载体系统，其包含：i)第一AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的启动子，启动子之后是编码肌球蛋白多肽的N端部分的部分编码序列，随后是剪接供体位点和第一内含子，以及ii)第二AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的第二内含子和针对所述第一内含子的剪接接受体位点，其中所述第一内含子和所述第二内含子的核苷酸序列包含有重叠的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV载体多核苷酸包含选自SEQ ID NO：73的核苷酸序列；并且所述第二AAV载体多核苷酸包含选自SEQ ID NO：75的核苷酸序列。66.多核苷酸载体系统，其包含：i)第一AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的启动子，启动子之后是编码肌球蛋白多肽的N端部分的部分编码序列，随后是剪接供体位点和第一内含子，以及ii)第二AAV载体多核苷酸，其包含在所述多核苷酸的每一端的反向末端重复，和在所述反向末端重复之间的第二内含子和针对所述第一内含子的剪接接受体位点，其中所述第一内含子和所述第二内含子的核苷酸序列包含有重叠的多核苷酸序列，并且其中所述第一AAV载体多核苷酸编码与SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列；并且所述第二AAV载体多核苷酸编码与SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％...

【专利技术属性】
技术研发人员：香农，
申请(专利权)人：佛罗里达州大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：