南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡的方法技术

本发明专利技术公开了南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡的方法，涉及分子微生物学技术领域，其技术要点为：包括以下步骤：S1、寡孢节丛孢Arthrobotrysoligospora的培养；S2、寡孢节丛孢细胞外囊泡的获得及表征分析；S3、捕食线虫真菌寡孢节丛孢细胞外囊泡的荧光标记；S4、南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡。本发明专利技术首次报道了南方根结线虫可吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡，这对于理解食线虫真菌与线虫互作机制具有重要意义，同时在线虫生物防治领域也展现出了潜在的应用价值。展现出了潜在的应用价值。展现出了潜在的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡的方法


[0001]本专利技术涉及分子微生物学
，具体涉及南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡的方法。

技术介绍

[0002]植物寄生线虫是世界各地严重危害农作物的害虫，许多植物寄生线虫对经济造成了严重的影响。其中南方根结线虫主要通过二龄幼虫(J2)阶段去寄生植物，它通过头部的化感神经系统识别土壤环境中来自植物寄主分泌的化合物，从而感知到植物寄生，定位到植物根系，完成侵染，并在其根系形成根结。根结线虫寄生于植物根系维管束中，导致根部组织突起、腐烂，植物受到水分胁迫，营养缺失，导致植物枯萎死亡。目前对于植物寄生线虫已有多种防治方法，包括培育抗性品种、化学杀线虫剂等，而其他策略，如作物轮作和耐药品种也存在严重的局限性。使用杀线虫剂作为化学防治手段是对付植物寄生线虫最有效的方法，但常常对环境造成污染，对人体产生伤害。使用生物法防治根结线虫病是目前较为有效的方法。通过微生物产生的次级代谢产物制成生物制剂去防治根结线虫，或者利用植物组织提取物的天然杀虫剂对线虫进行防治。
[0003]线虫防治真菌种类繁多、分布广泛、规模十分庞大。在线虫存在的情况下，它们会从腐生型向捕食型转变，这对调控生态系统中线虫种群平衡起到重要作用。根据侵染线虫的方式不同，可分为捕食线虫真菌、内寄生线虫真菌、产毒真菌和机会真菌。不同种类的捕食线虫真菌获取营养的方式不同，绝大多数既能营腐生生活也能用寄生的方式吸收营养，生活在有机质环境中营腐生生活，存在线虫时又能转变为寄生生活模式，产生各种特殊的菌丝结构。捕食线虫真菌为了捕获线虫，可以通过营养菌丝分化不同形态的捕器以此来捕获线虫，例如无结菌丝、三维菌网、粘性分支、收缩环、粘球和非收缩环。这些不同形态特征的捕器提高了真菌捕食线虫的能力，使得捕食线虫真菌成为众多科研人员炙手可热的硏究对象，导致他们不遗余力地研究真菌和病原线虫之间的关系，以期寻求更有效的方式控制线虫的危害。
[0004]包含原核生物和真核生物在内的所有细胞，都会释放细胞外囊泡(EVs)作为其正常生理机能的一部分。根据起源细胞的不同，EVs包含细胞的许多成分，包括DNA、RNA、脂质、代谢物以及细胞溶质和细胞表面蛋白。产生细胞外囊泡的生理目的在很大程度上仍然未知，需要研究。一种推测的作用是EVs可能会从细胞中去除多余或不必要的成分以维持细胞稳态。目前众多研究发现EVs在功能性、靶向性、机制驱动等方面扮演重要角色，表明它们在调节细胞间通讯中发挥作用。
[0005]南方根结线虫因口针直径小而很难吞食相关物质，研究表明寡孢节丛孢菌的细胞外囊泡粒径小于线虫口针直径，因而可被南方根结线虫吞食。有趣的是，本申请专利技术人研究发现吞食囊泡的南方根结线虫运动明显减缓，为寡孢节丛孢捕器形成预留了时间，最终降低了线虫逃跑的概率，这有助于寡孢节丛孢捕食效率的提高，是寡孢节丛孢进化的产物。本申请在线虫生防领域提出了关于细胞外囊泡的新的见解。
[0006]目前，尚未有南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡的报道。
[0007]因此，本专利技术旨在提供一种南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡的方法，以解决上述问题。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是为了解决上述问题，提供南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡的方法，本专利技术首次报道了南方根结线虫可吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡，这对于理解食线虫真菌与线虫互作机制具有重要意义，同时在线虫生物防治领域也展现出了潜在的应用价值。
[0009]为了达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡的方法，包括以下步骤：
[0010]S1、寡孢节丛孢Arthrobotrys oligospora的培养：
[0011]Step1：寡孢节丛孢的复壮
[0012]采用TYGA固体培养基复壮菌种库中的寡孢节丛孢，PDA固体培养基正常培养复壮后的寡孢节丛孢；
[0013]Step2：寡孢节丛孢的培养
[0014]将步骤Step1中复壮后的TYGA菌块接种于6cm的固体PDA平板于28℃培养5天；
[0015]S2、寡孢节丛孢细胞外囊泡的获得及表征分析：
[0016]将PDA菌块接种于TG液体培养基于28℃静置培养4天后，于28℃，180rpm摇床培养48小时，过滤菌丝收集上清液；将上清液通过梯度离心后采用0.22μm的滤头过滤，对获得的液体进行超速离心后获得沉淀，然后采用PBS重悬沉淀，并再次超速离心后回收沉淀，所获的沉淀即为寡孢节丛孢的细胞外囊泡；
[0017]使用透射电镜观察细胞内多泡体和细胞外囊泡的形态；纳米颗粒跟踪分析检测囊泡浓度及粒径；
[0018]S3、捕食线虫真菌寡孢节丛孢细胞外囊泡的荧光标记：
[0019]利用BCA法对获得的寡孢节丛孢细胞外囊泡进行蛋白浓度定量分析，随后利用绿色荧光染料pKH67对细胞外囊泡进行荧光标记；
[0020]S4、南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡：
[0021]将蛋白浓度为100μg荧光标记的细胞外囊泡与南方根结线虫于28℃孵育培养96h；
[0022]设置对照组：加入等体积的PBS与等量的南方根结线虫于28℃孵育培养96h；
[0023]在荧光显微镜下观察南方根节线虫体内荧光定位情况。
[0024]进一步地，步骤S1中所述的TYGA固体培养基为1L，所述PDA固体培养基为1L；
[0025]所述TYGA固体培养基制备方法为：
[0026]称取10g胰蛋白胨，10g葡萄糖，5g酵母提取物，10g糖蜜，并将称取的胰蛋白胨、葡萄糖、酵母提取物和糖蜜溶解于800mL去离子水中，待完全溶解后加入20g琼脂粉，最终定容至1L，于121℃高压灭菌20分钟后备用；
[0027]所述PDA固体培养基的制备方法为：
[0028]称取200g马铃薯，并将其切成小块后于800mL去离子水中煮30分钟，过滤去除马铃薯残渣后向液体中加入20g葡萄糖和15g琼脂粉，最终定容至1L，于121℃高压灭菌20分钟后
备用。
[0029]进一步地，步骤S2中所述的TG液体培养基为1L；
[0030]所述TG液体培养基的制备方法为：
[0031]称取10g葡萄糖，10g胰蛋白胨，采用去离子水将其溶解定容至1L后，于121℃高压灭菌20分钟后备用。
[0032]进一步地，步骤S2的具体方法为：
[0033]将3个培养5天的PDA平板接种于200mL的TG液体培养基中，于28℃静置培养4天，随后以28℃，180rpm的条件摇床培养2天，用灭菌的漏斗过滤多余的菌丝及琼脂块；将得到的上清过0.22μm的滤膜后，以4000g的转速4℃离心15分钟，进一步去除菌丝沉淀；随后以10000g的转速4℃离心15分钟，去除细胞碎片；以100KD的超滤管对液体进行浓缩后再次过0.22μm的滤膜；以100000g的转速4℃离心70分钟得到细胞外囊泡沉淀；
[0034]采用4℃的PB本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡的方法，其特征是：包括以下步骤：S1、寡孢节丛孢Arthrobotrys oligospora的培养：Step1：寡孢节丛孢的复壮采用TYGA固体培养基复壮菌种库中的寡孢节丛孢，PDA固体培养基正常培养复壮后的寡孢节丛孢；Step2：寡孢节丛孢的培养将步骤Step1中复壮后的TYGA菌块接种于6cm的固体PDA平板于28℃培养5天；S2、寡孢节丛孢细胞外囊泡的获得及表征分析：将PDA菌块接种于TG液体培养基于28℃静置培养4天后，于28℃，180rpm摇床培养48小时，过滤菌丝收集上清液；将上清液通过梯度离心后采用0.22μm的滤头过滤，对获得的液体进行超速离心后获得沉淀，然后采用PBS重悬沉淀，并再次超速离心后回收沉淀，所获的沉淀即为寡孢节丛孢的细胞外囊泡；使用透射电镜观察细胞内多泡体和细胞外囊泡的形态；纳米颗粒跟踪分析检测囊泡浓度及粒径；S3、捕食线虫真菌寡孢节丛孢细胞外囊泡的荧光标记：利用BCA法对获得的寡孢节丛孢细胞外囊泡进行蛋白浓度定量分析，随后利用绿色荧光染料pKH67对细胞外囊泡进行荧光标记；S4、南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡：将蛋白浓度为100μg荧光标记的细胞外囊泡与南方根结线虫于28℃孵育培养96h；设置对照组：加入等体积的PBS与等量的南方根结线虫于28℃孵育培养96h；在荧光显微镜下观察南方根节线虫体内荧光定位情况。2.如权利要求1所述的南方根结线虫吞食寡孢节丛孢细胞外囊泡的方法，其特征是：步骤S1中所述的TYGA固体培养基为1L，所述PDA固体培养基为1L；所述TYGA固体培养基制备方法为：称取10g胰蛋白胨，10g葡萄糖，5g酵母提取物，10g糖蜜，并将称取的胰蛋白胨、葡萄糖、酵母提取物和糖蜜溶解于800mL去离子水中，待完全溶解后加入20g琼脂粉，最终定容至1L，于121℃高压灭菌20分钟后备用；所述PDA固体培养基的制备方法为：称取200g马铃薯，并将其切成小块后于800mL去离子水中煮30分钟，过滤去除马铃薯残渣后向液体中加入20g葡萄糖和15g琼脂粉，最终定容至1L，于121℃高压灭菌20分钟后备用。3.如权利要求1所述的南方根结线虫...

【专利技术属性】
技术研发人员：张克勤，周亮，王芯，康佳磊，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：