一种高效制备烟酰胺单核苷酸的方法及融合蛋白技术

本发明专利技术提供了一种融合蛋白及其在制备生产烟酰胺单核苷酸的催化剂中的应用，所述融合蛋白包括使用linker相连的烟酰胺核糖激酶NRK和ATP循环酶。本发明专利技术还提供了一种蛋白组合及其应用，所述蛋白组合包括上述融合蛋白中的烟酰胺核糖激酶NRK和ATP循环酶。本发明专利技术还提供了编码上述融合蛋白或蛋白组合的核酸、含有该核酸的重组表达载体以及含有该核酸或该重组表达载体的转化体以及它们的应用。本发明专利技术还提供了一种高效制备烟酰胺单核苷酸的方法，该方法使用了上述融合蛋白或蛋白组合，具有酶的活性高、底物浓度高以及反应效率高的进步效果。底物浓度高以及反应效率高的进步效果。

【技术实现步骤摘要】
一种高效制备烟酰胺单核苷酸的方法及融合蛋白


[0001]本专利技术属于生物合成领域，具体涉及一种高效制备烟酰胺单核苷酸的方法及可用于制备烟酰胺单核苷酸的融合蛋白或蛋白组合，还涉及编码融合蛋白的分离的核酸、含其的载体和转化体。

技术介绍

[0002]β
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烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，缩写成NMN)是生物体内存在的一种物质，它在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即转化成生物细胞所赖以生存的重要物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+，又称辅酶I)。2017年3月David Scinclair研究团队发表在《Science》上的一项研究表明，NAD+在小鼠体内的增加，使得大龄小鼠的组织和肌肉衰老迹象被逆转，这表明人类返老还童不再是梦想。由于NAD+分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，其体内主要依赖于细胞的合成，而且合成量很低。但随着对NAD+前体小分子物质NMN的研究发现，食用自NMN可以有效提升体内NAD+的含量升高，并显著抑制衰老引起的新陈代谢，使得自NMN成为了“不老神药”。截至目前，人们已经发现烟酰胺单核苷酸具有诸如延缓衰老、治疗帕金森等老年病、调节胰岛素分泌、影响mRNA的表达等诸多医疗保健用途。
[0003]目前合成NMN的主要方法包括：化学合成、生物催化法。其中化学法成本高，同时造成严重的环境污染，己逐渐被生物催化法取代。相比较而言，生物酶法催化生产NMN更加高效、成本更低、节能环保。目前，有三种生物催化方法生产NMN，第一种是以烟酰胺核糖(NR)为原料，通过烟酰胺核糖激酶(Ribosylnicotinamide kinase，EC 2.7.1.22，简写NRK酶)在ATP供应下生成NMN。第二种是以烟酰胺、核糖和ATP为底物，经D
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核糖激酶(Ribokinase，EC 2.7.1.15)、核酸磷酸焦磷酸激酶(ribose phosphate pyrophosphokinase，EC 2.7.6.1)、和烟酰胺核糖磷酸转移酶(Nicotinamide phosphoribosyltransferase，EC.2.4.2.12)催化反应生成NMN。第三种是以腺苷或AMP、ATP、烟酰胺为原料，经腺苷激酶(EC 2.7.1.20)(以AMP为原料时不需要此酶)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(EC 2.4.2.7)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，EC.2.4.2.12)催化生成NMN。
[0004]上述第二种、第三种方法最后均以5
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磷酸核糖基
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焦磷酸(Phosphoribosyl pyrophosphate，PRPP)和烟酰胺通过烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphoribosyltransferase，EC.2.4.2.12)制备NMN。因烟酰胺磷酸核糖转移酶催化为可逆反应，合成NMN的同时也能水解NMN，反应转化率较低。同时，中间体PRPP化合物的合成难以实现且PRPP不稳定，收率非常低，不利于反应进行，成为了反应的主要限制条件。
[0005]而上述第一种方法直接以烟酰胺核糖为原料，底物转化率高，收率高，产品纯度高，未来将成为NMN的主流生产方法。目前已经有专利公开了一种新的烟酰胺核糖激酶及其突变体作为工业酶在催化合成β
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烟酰胺单核苷酸中的方法与应用(专利号：CN110373398A)。但在单一的NRK条件下，ATP使用量大，成本高，后提取难度大。
[0006]有研究表明，在某些细菌体内存在利用多聚磷酸或其盐再生ATP的酶系。该酶系包括多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1，Ppk)、腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3，Adk)和多聚磷酸腺苷酸磷酸
转移酶(EC 2.7.4.
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，Pap)，其中，Ppk催化ADP与多聚磷酸或其盐反应生成ATP，Adk催化2分子ADP生成1分子ATP和1分子AMP，Pap则催化AMP与多聚磷酸或其盐反应生成ADP。它们均可以帮助酶促反应中消耗的ATP循环再生，大大降低生产过程中ATP的用量，本专利技术统称这三种酶为“ATP循环酶”。目前已经有专利公开建立了这几种ATP循环酶的回收体系，并证明适用于工业化大规模生产(专利号：CN105861598A)。
[0007]此外，目前已经公开了一种β
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烟酰胺单核苷酸的酶催化合成方法(专利号：CN112795606A)，以腺苷、烟酰胺、ATP或其盐、多聚磷酸激酶、镁离子、多聚磷酸盐为原料，在EC编号为EC 2.4.2.1的嘌呤核苷磷酸化酶(purine
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nucleoside phosphorylase，简写PNP)和烟酰胺核糖激酶NRK的催化作用下合成β
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烟酰胺单核苷酸，并且反应过程生成的ADP在多聚磷酸激酶的作用下实现ATP循环再生，降低生产成本。
[0008]但本领域缺乏一种进一步提高NMN的生产效率的方法。

技术实现思路

[0009]本专利技术解决的技术问题是为了克服本领域缺乏一种高效生产β
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烟酰胺单核苷酸(NMN)的缺陷，提供了一种高效制备烟酰胺单核苷酸的方法及融合蛋白。
[0010]本专利技术将烟酰胺核糖激酶(NRK)和ATP循环酶以linker连接成为融合蛋白，并发酵生产此融合蛋白，将发酵所得融合蛋白作为催化剂，不仅能够高效将烟酰胺核糖(NR)或其氯化物催化生成NMN，并且能够同步实现ATP的循环利用，大大降低了ATP的投料量，减轻了分离纯化的工作量，提高了NMN生产效率。
[0011]本专利技术的技术原理是，将烟酰胺核糖激酶(NRK)基因和ATP循环酶(多聚磷酸激酶，Ppk)基因用linker相连，形成一个融合蛋白基因，将该基因转化入一株表达菌体中，得到同时具备NRK和Ppk的功能的融合蛋白(酶)及含有此融合蛋白(酶)的菌体，以发酵所得菌体或者破碎菌体得到的酶为催化剂，能在极少ATP条件下，以更加廉价的六偏磷酸钠提供磷酸基团，完成NR至NMN的高效转化。
[0012]本专利技术的技术方案之一为：提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括烟酰胺核糖激酶NRK和ATP循环酶。
[0013]在一些优选的实施例中，所述ATP循环酶为Ppk。
[0014]较佳地，所述Ppk来源于大肠杆菌，所述NRK来源于流感嗜血杆菌。
[0015]更佳地，所述NRK的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述Ppk的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0016]在一些更优选的实施例中，所述NRK与Ppk之间有或没有通过连接子L连接。
[0017]较佳地，所述融合蛋白的结构为NRK
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L
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Ppk或Ppk
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L
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NRK。
[0018]和/或，所述L的氨基酸序列如SEQ ID NO:本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括烟酰胺核糖激酶NRK和ATP循环酶。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述ATP循环酶为多聚磷酸激酶Ppk；较佳地，所述Ppk来源于大肠杆菌，所述NRK来源于流感嗜血杆菌；更佳地，所述NRK的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述Ppk的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述NRK与Ppk之间有或没有通过连接子L连接；较佳地，所述融合蛋白的结构为NRK
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L
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Ppk或Ppk
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L
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NRK；和/或，所述L的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。4.一种蛋白组合，其特征在于，其包括如权利要求2所述的融合蛋白中的烟酰胺核糖激酶NRK和ATP循环酶。5.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1～3任一项所述的融合蛋白，或如权利要求4所述的蛋白组合；优选地，当所述分离的核酸包括NRK、Ppk和/或L时，编码所述NRK的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；编码所述Ppk的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码所述L的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括如权利要求5所述的分离的核酸；较佳地，所述NRK和Ppk在同一个重组表达载体上；更佳地，所述重组表达载体的骨架质粒为pET28...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙华君，熊淑婷，郭晨，赵威，江汝泳，谈敏，郑艳，唐佳乐，钱志强，
申请(专利权)人：湖北远大生命科学与技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：