L-苏氨酸生产菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种L

【技术实现步骤摘要】
L
‑
苏氨酸生产菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种L
‑
苏氨酸生产菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]L
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苏氨酸是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。目前L
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苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于L
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苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型(日本专利申请公开号224684/83；韩国专利申请公开号8022/87)。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。
[0003]随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第
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56至
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18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。Kwang Ho Lee(Kwang Ho Lee等,Systems metabolic engineering of Escherichia coli for L
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threonine production,Mol Syst Biol.2007；3：149)等利用系统代谢工程策略，通过突变编码天冬氨酸激酶I和III的基因thrA、lysC解除产物反馈抑制，通过敲除tdh及弱化ilvA来去除副产物甘氨酸、异亮氨酸，通过失活竞争途径基因metA和lysA为苏氨酸合成提供了更多前体等，最终获得的TH28C(pBRThrABCR3)菌株发酵50h可产酸82.4g/L，糖酸转化率39.3％。2020年梅花集团申请的中国专利ZL201611250306.8中，通过强化pntAB基因和异源引入pyc基因获得MHZ
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0215
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2菌株，该菌株苏氨酸产量为12.4g/L、转化率约为16.2％且无质粒负担。其中CreBC双组分系统是全局感应调节系统，与其他全局调节因子一样，CreBC影响着细菌生理学的许多不同方面。其中CreC对碳分解代谢和细胞内氧化还原状态有影响，并且在低氧条件下，还影响大肠杆菌的生长和发酵特性，因此被用于代谢工程生产代谢产物。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种L
‑
苏氨酸生产菌株及其构建方法与应用。
[0005]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种CreC蛋白突变体，所述突变体包含CreC蛋白第77位氨基酸由R到P的突变。
[0006]本专利技术中，CreC蛋白在NCBI上的参考序列编号为NP_418816.1。
[0007]第二方面，本专利技术提供编码所述CreC蛋白突变体的核酸分子(包含CGC
→
CCC突变)。
[0008]第三方面，本专利技术提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
[0009]第四方面，本专利技术提供所述核酸分子或权利要求3所述生物材料的以下任一应用：
[0010](1)用于L
‑
苏氨酸发酵生产；
[0011](2)用于提高L
‑
苏氨酸发酵产量；
[0012](3)用于构建产L
‑
苏氨酸基因工程菌。
[0013]第五方面，本专利技术提供一种L
‑
苏氨酸生产菌株的构建方法，利用基因工程手段，在具有苏氨酸生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的CreC蛋白包含R77P突变位点。
[0014]优选地，所述细菌为埃希氏菌属(Escherichia)菌种，更优选大肠杆菌(Escherichia coli)，如菌株MHZ
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2(参见ZL201611250306.8)。
[0015]菌株MHZ
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4(creC R77P)的构建方法包括以下步骤：
[0016]A、pTargetF
‑
N20(creC R77P)质粒及Donor DNA的构建
[0017]A1：以pTargetF质粒为模板，用pTF
‑
sgRNA
‑
F/pTF
‑
sgRNA
‑
R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1
‑
T1感受态细胞，获得pTargetF
‑
N20(creC R77P)质粒，并进行PCR鉴定及测序验证；A2：以W3110基因组为模板，用creC
‑
UF/creC
‑
UR引物对，扩增出上游同源臂
①
；A3：以W3110基因组为模板，用creC
‑
DF/creC
‑
DR引物对扩增出下游同源臂
②
；A4：以
①
、
②
为模板，用creC
‑
UF/creC
‑
DR引物对，扩增出up
‑
creC
‑
down片段，也称Donor DNA。
[0018]其中，creC在NCBI中Gene ID：948609。
[0019]B、感受态细胞制备及电转化
[0020]B1：将pCas质粒电转入MHZ
‑
0215
‑
2感受态细胞中，得到阳性转化子MHZ
‑
0215
‑
2(pCas)；B2：挑取MHZ
‑
0215
‑
2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD
650
为0.4后制备电转感受态细胞；B3：将pTargetF
‑
N20(creC R77P)质粒电转入MHZ
‑
0215
‑
2(pCas)感受态细胞中，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。
[0021]C、重组验证
[0022]C1：使用引物对creC
‑
F/creC
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R对上述单菌落进行菌落PCR扩增；C2：将扩增产物送测序，以验证序列的完整性。
[0023]D、构建相关质粒丢失
[0024]D1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CreC蛋白突变体，其特征在于，所述突变体包含CreC蛋白第77位氨基酸由R到P的突变；其中，CreC蛋白在NCBI上的参考序列编号为NP_418816.1。2.编码权利要求1所述CreC蛋白突变体的核酸分子。3.含有权利要求2所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。4.权利要求2所述核酸分子或权利要求3所述生物材料的以下任一应用：(1)用于L
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苏氨酸发酵生产；(2)用于提高L
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苏氨酸发酵产量；(3)用于构建产L
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苏氨酸基因工程菌。5.L
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苏氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，利用基因工程手段，在具有苏氨酸生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的CreC蛋白包含R77P突变位点；其中，CreC蛋白在NCBI上的参考序列编号为NP_418816.1；优选地，所述细菌为埃希氏菌属(Escherichia)菌种。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为菌株MHZ
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0215
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2。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、pTargetF
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N20(creC R77P)质粒及Donor DNA的构建A1：以pTargetF质粒为模板，用pTF
‑
sgRNA
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F/pTF
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sgRNA
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R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1
‑
T1感受态细胞，获得pTargetF
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N20(creC R77P)质粒，并进行PCR鉴定及测序验证；A2：以W3110基因组为模板，用creC
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UF/creC
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UR引物对，扩增出上游同源臂
①
；A3：以W3110基因组为模板，用creC
‑
DF/creC
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DR引物对扩增出下游同源臂
②
；A4：以
①
、
②
为模板，用creC
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UF/creC
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DR引物对，扩增出up
‑
creC
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down片段，也称Donor DNA；B、感受态细胞制备及电转化B1：将pCas质粒电转入MHZ
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2感受态细胞中，得到阳性转化子MHZ
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2(pCas)；B2：挑取MHZ
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2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD
650
为0.4后制备电转感受态细胞；B3：将pTargetF
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N20(creC R77P)质粒电转入MHZ
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0215
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2(pCas)感受态细胞中，涂布于含壮观霉...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹春筱，刘慧敏，康培，
申请(专利权)人：李岩，
类型：发明
国别省市：