测定外泌体含量的检测方法及应用技术

本申请提供一种测定外泌体含量的检测方法及应用。其中，所述方法包括：制备包含外泌体的待测样品溶液；利用TIM4蛋白包被酶标板；在包被完成的酶标板中加入待测样品溶液；在包含外泌体的酶标板中加入浓度最低为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液；加入包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液；加入显色液、显色终止液；通过选用第一波长的测试光波的酶标仪检测吸光度；根据吸光度的检测结果并通过吸光度

【技术实现步骤摘要】
测定外泌体含量的检测方法及应用


[0001]本申请涉及生物技术检测
，尤其涉及一种测定外泌体含量的检测方法及应用。

技术介绍

[0002]外泌体是直径在30
‑
150nm的细胞外囊泡，由几乎所有的细胞分泌。外泌体通过运输其携带的蛋白质、脂质和核酸等物质，在细胞之间的通讯中发挥着重要作用。近年来，对于外泌体的研究日益丰富。外泌体的检测在外泌体的研究及应用中有很重要的作用。例如，对不同来源及不同处理方式的外泌体数量进行对比分析；支持药效药理分析评价；质量控制等。传统的蛋白免疫印迹实验方法费时费力，需要两天的实验时间且不能实现对外泌体高效定量；纳米粒子追踪分析与纳米流式仪的设备价格昂贵，难以普及频繁使用；BCA蛋白浓度检测只能测定样本中的总蛋白量，不能实现针对外泌体的浓度的鉴定。因此，越来越多的人采用酶联免疫吸附测定ELISA进行外泌体的定量检测。通过酶联免疫吸附测定进行外泌体的定量检测时，通常将CD63、CD81等特异性蛋白作为一抗的抗体。
[0003]在实现现有技术的过程中，专利技术人发现：采用相同浓度的CD63与CD81进行外泌体的特异性结合，其对外泌体的结合效率有着较大的差异。即，相同条件下，CD63与CD81对外泌体有着不同的灵敏度。相同条件下，若选用对外泌体灵敏度交底的标志蛋白作为一抗，将进一步影响到酶联免疫吸附测定的检测结果，使其准确度降低。选用对外泌体灵敏度交底的标志蛋白作为一抗，需要提高一抗溶液的浓度，增大了检测成本。
[0004]因此，需要提供一种能够提高酶联免疫吸附测定结果准确度且检测成本低的技术方案。

技术实现思路

[0005]本申请实施例提供一种测定外泌体含量的检测方法及应用，用以解决酶联免疫吸附测定中，用于结合外泌体的一抗抗体灵敏度低导致检测结果准确度差的技术问题。
[0006]具体的，一种测定外泌体含量的检测方法，包括：制备包含外泌体的待测样品溶液；利用TIM4蛋白溶液进行酶标板的包被，得到被TIM4蛋白包被的酶标板；在所述被TIM4蛋白包被的酶标板中加入所述待测样品溶液，通过包被于酶标板的TIM4蛋白捕获所述待测样品溶液中的外泌体，得到包含第一个数数量外泌体的酶标板；在所述包含第一个数数量外泌体的酶标板中，加入浓度最低为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液，得到结合有抗人CD63一抗抗体的酶标板；在所述结合有抗人CD63一抗抗体的酶标板中，加入具有第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液，得到结合有被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的酶标板；
在所述结合有被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的酶标板中，加入显色液，进行辣根过氧化物酶与显色液的显色反应；当所述显色反应持续第一时长后，在显色完成后的酶标板中加入显色终止液，以终止所述显色反应；通过选用第一波长的测试光波的酶标仪，检测显色终止后的酶标板的吸光度；根据所述吸光度的检测结果，并通过吸光度
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外泌体个数的函数，计算酶标板中外泌体的个数。
[0007]进一步的，在所述包含第一个数数量外泌体的酶标板中，加入浓度最低为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液，具体包括：在所述包含第一个数数量外泌体的酶标板中，加入浓度为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液。
[0008]进一步的，加入具有第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液，具体包括：加入浓度最低为1:2000的第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液。
[0009]进一步的，加入浓度最低为1:2000的第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液，具体包括：加入浓度为1:2000的第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液。
[0010]进一步的，利用TIM4蛋白溶液进行酶标板的包被，得到被TIM4蛋白包被的酶标板，具体包括：在酶标板中加入TIM4蛋白溶液，以进行TIM4蛋白与酶标板的结合，得到结合有TIM4蛋白的酶标板；在所述结合有TIM4蛋白的酶标板中加入含有与TIM4蛋白不相关的蛋白的封闭液，进行酶标板的封闭。
[0011]进一步的，在所述方法还包括：当所述吸光度的检测结果高于预设的第一阈值时，对所述待测样品溶液执行稀释操作。
[0012]进一步的，通过选用第一波长的测试光波的酶标仪，检测显色终止后的酶标板的吸光度，具体包括：通过选用第一波长为450nm的测试光波的酶标仪，检测显色终止后的酶标板的吸光度。
[0013]进一步的，制备包含外泌体的待测样品溶液，具体包括：制备包含来源于人脐带间充质干细胞的外泌体的待测样品溶液。
[0014]本申请实施例还提供一种测定外泌体含量的检测方法在酶联免疫吸附测定试剂盒中的应用。
[0015]本申请实施例提供的技术方案，至少具有如下有益效果：通过选用浓度低、灵敏度高的CD63标志蛋白作为一抗抗体进行外泌体的特异性结合，能够实现利用低浓度CD63的一抗溶液达到较高的检测准确度。这样，在保证外泌体定量
检测结果的准确度的同时，还可以降低检测成本。
附图说明
[0016]此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1为本申请实施例提供的一种测定外泌体含量的检测方法的流程示意图。
[0017]图2为本申请实施例提供的一种吸光度
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外泌体个数的曲线对比图。
具体实施方式
[0018]为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例及相应的附图对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
[0019]可以理解的是，进行外泌体含量的检测，能够为药效药理分析评价、质量控制等方面提供有力的支持。目前，进行外泌体含量的检测，可以通过蛋白免疫印迹实验方法、纳米粒子追踪分析、BCA蛋白浓度检测等方法。但是，蛋白免疫印迹方需要两天的实验时间，且不能实现对外泌体高效定量，费时费力；纳米粒子追踪分析与纳米流式仪的设备价格昂贵，难以普及频繁使用；BCA蛋白浓度检测只能测定样本中的总蛋白量，不能实现针对外泌体的浓度的鉴定。因此，越来越多的人采用简便、高效的酶联免疫吸附测定ELISA进行外泌体的定量检测。
[0020]实际应用中，可以通过双抗体夹心酶联免疫吸附测定ELISA法进行外泌体含量的检测。采用此方法时，在将外泌体捕获之后，需要将能够与其特异性结合的蛋白作为一抗抗体，并利用被相关酶标记的、能够与一抗抗体结合的二抗抗体进行一抗抗体的结合。之后，在二抗抗体标记酶的催化下，显色液开始显色。加入终止液，显色结束。通过酶标仪，并在一定的波长下即可测得相应酶标板的吸光度。吸光度的测量结果可以用光密度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定外泌体含量的检测方法，其特征在于，包括：制备包含外泌体的待测样品溶液；利用TIM4蛋白溶液进行酶标板的包被，得到被TIM4蛋白包被的酶标板；在所述被TIM4蛋白包被的酶标板中加入所述待测样品溶液，通过包被于酶标板的TIM4蛋白捕获所述待测样品溶液中的外泌体，得到包含第一个数数量外泌体的酶标板；在所述包含第一个数数量外泌体的酶标板中，加入浓度最低为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液，得到结合有抗人CD63一抗抗体的酶标板；在所述结合有抗人CD63一抗抗体的酶标板中，加入具有第一浓度值、包含被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的二抗溶液，得到结合有被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的酶标板；在所述结合有被辣根过氧化物酶标记的二抗抗体的酶标板中，加入显色液，进行辣根过氧化物酶与显色液的显色反应；当所述显色反应持续第一时长后，在显色完成后的酶标板中加入显色终止液，以终止所述显色反应；通过选用第一波长的测试光波的酶标仪，检测显色终止后的酶标板的吸光度；根据所述吸光度的检测结果，并通过吸光度
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外泌体个数的函数，计算酶标板中外泌体的个数。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述包含第一个数数量外泌体的酶标板中，加入浓度最低为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液，具体包括：在所述包含第一个数数量外泌体的酶标板中，加入浓度为1:6000、包含抗人CD63一抗抗体的一抗溶液。3.如权利要求2所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜羽宣，张振宇，
申请(专利权)人：北京艾瑞克阳医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：