一种通过降低线粒体温度提高卵母细胞冷冻效果的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过降低线粒体温度提高卵母细胞冷冻效果的方法，属于卵母细胞冷冻技术领域。本发明专利技术在卵母细胞冷冻前采用含二甲双胍的培养液进行预处理；然后将预处理后的卵母细胞置于20％乙二醇溶液中进行平衡处理，再置于玻璃化冷冻液中进行冷冻，并投入液氮冷冻保存。本发明专利技术的方法可有效降低猪卵母细胞线粒体温度，降低细胞膜流动性，且不影响孤雌激活后胚胎发育，可恢复解冻后卵母细胞线粒体温度，有效改善解冻存活率，提高冷冻卵母细胞利用效率，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种通过降低线粒体温度提高卵母细胞冷冻效果的方法


[0001]本专利技术属于卵母细胞冷冻
，特别是涉及一种通过降低线粒体温度提高卵母细胞冷冻效果的方法。

技术介绍

[0002]猪成熟卵母细胞冷冻对种质资源库建立及生物医学研究均具有重要意义。目前，猪卵母细胞冷冻存活率较低，不同实验室冻存效率差异较大(10％
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70％)，冷冻效率无法满足生产需要，仍停留在科研阶段，亟需开发有效的超低温保存方法。
[0003]近年来，人们发现脂肪颗粒(Lipid Droplets,LDS，脂肪以颗粒形式存在)的大量沉积可造成卵母细胞抗冻性降低。不同物种卵母细胞脂滴含量不同，例如猪卵母细胞中的平均脂肪含量为161ng，将近是羊卵母细胞(89ng)的2倍，牛卵母细胞(63ng)的3倍，小鼠(4ng)和人卵母细胞的40倍。在恒温动物中，细胞线粒体的产能一部分以ATP的形式参与细胞代谢，另一部分则以热能的形式释放来维持细胞的温度。当线粒体呼吸链负荷运转时，线粒体的温度可达50℃左右，这也意味着利用超低温冷冻技术进行冷冻时，对线粒体的损伤要远远大于其它细胞器。
[0004]二甲双胍是2型糖尿病的一线治疗药物，可通过增加外周组织，如肝脏及骨骼肌的葡萄糖吸收以维持葡萄糖稳态，因此广泛应用于胰岛素抵抗及2型糖尿病的治疗中。体内实验发现二甲双胍可逆转高脂饮食小鼠的超重、高糖、高脂及葡萄糖不耐受性。二甲双胍对卵母细胞线粒体温度的影响及其在冷冻技术的应用尚未见报道。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种能够有效降低线粒体温度的化合物，并评估其在卵母细胞冷冻中的作用，以期降低冷冻解冻过程中剧烈温度变化对线粒体的损伤，从而提高解冻后卵母细胞质量。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术目的之一是提供一种通过降低线粒体温度提高卵母细胞冷冻效果的方法，包括如下步骤：
[0008](1)卵母细胞冷冻前采用培养液进行预处理，所述培养液含二甲双胍；
[0009](2)将预处理后的卵母细胞置于20％乙二醇(EG)溶液中进行平衡处理，然后置于玻璃化冷冻液中进行冷冻，然后将卵母细胞置于Cryotop载杆前端，每根Cryotop可冷冻10
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20枚卵母细胞(根据操作人员熟练程度进行调整)投入液氮冷冻保存。
[0010]进一步地，所述卵母细胞的制备过程，包括如下步骤：
[0011]采集卵巢表面直径3～8mm卵泡中的卵丘
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卵母细胞复合体(COCs)，用TL
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HEPES
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0.3％BSA液清洗三次，再在体外成熟液中成熟培养42～44h至MⅡ期；成熟的COCs移入含0.1％透明质酸酶的H199液中迅速消化，除去颗粒细胞获得体外成熟的卵母细胞。
[0012]其中，体外成熟液为含2.78mM D
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葡萄糖，0.91mM丙酮酸钠，0.57mM半胱氨酸，
50mg/mL链霉素，75mg/mL青霉素，10％猪卵泡液(从猪卵巢卵泡内吸取的液体)，0.01U/mL促卵泡激素(FSH)，0.01U/mL促黄体生成素(LH)，10ng/mL表皮细胞生长因子(EGF)的TCM
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199液。
[0013]H199液为含0.01M 4
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羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，0.01M 4
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羟乙基哌嗪乙磺酸钠盐(HEPES
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NA)，5mM NaHCO3，50mg/mL链霉素，65mg/mL青霉素的TCM
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199液。
[0014]进一步地，步骤(1)所述培养液为Tyrode's lactate(TL)
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HEPES
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0.3％BSA液。
[0015]TL
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HEPES
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0.3％BSA液含6.662g/L NaCl，0.238g/L KCl，0.168g/L NaHCO3，0.046g/L KH2PO4，2.383g/L HEPES，0.022g/L丙酮酸钠，1.121g/L乳酸钠，2.186g/L山梨醇，0.01g/L链霉素，0.05g/L青霉素，0.102g/L MgCl2·
6H2O，0.294g/L CaCl2·
2H2O，3g/L BSA。
[0016]进一步地，所述培养液含有400μM二甲双胍。
[0017]进一步地，步骤(1)所述预处理的时间为1h。
[0018]进一步地，步骤(2)所述平衡处理的时间为3min。
[0019]进一步地，步骤(2)所述玻璃化冷冻液为EDFS40，所述冷冻的时间为30～40s。
[0020]本专利技术的有益效果：
[0021]本专利技术通过二甲双胍降低线粒体温度，从而提高卵母细胞冷冻效果，其中，二甲双胍可显著降低卵母细胞线粒体温度，降低细胞膜流动性，且不影响卵母细胞发育能力。冷冻前经二甲双胍预处理可改善解冻后卵母细胞脂滴超微结构，有助于线粒体温度恢复，提高解冻后存活率，有效提高冷冻卵母细胞利用率，对卵母细胞冷冻保存效率的提高具有重要意义和广泛应用前景。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]图1为不同浓度二甲双胍处理对猪卵母细胞线粒体温度的影响，A图为线粒体温度探针MTY荧光染色图，B图为荧光强度比较；
[0024]图2为二甲双胍对猪卵母细胞发育的影响，A图为卵母细胞成熟及孤雌胚胎发育图，B、C图为对照组与二甲双胍处理组卵裂率及囊胚发育率比较；
[0025]图3为二甲双胍处理对猪卵母细胞质膜流动性的影响，A图为质膜漂白后荧光在不同时间的恢复情况，B图为质膜漂白后荧光强度随时间的变化情况；
[0026]图4为二甲双胍对猪冷冻卵母细胞存活的影响，A为新鲜卵母细胞FDA染色；B为常规冷冻解冻卵母细胞FDA染色；C为二甲双胍预处理后冷冻解冻卵母细胞FDA染色；
[0027]图5为二甲双胍对解冻卵母细胞线粒体温度的影响，A图为解冻卵母细胞中MTY探针荧光染色，B图为对照组、冷冻组、二甲双胍预处理冷冻组MTY荧光强度比较；
[0028]图6为二甲双胍对解冻卵母细胞脂滴超微结构的影响，A为新鲜卵母细胞；B为常规冷冻解冻卵母细胞；C为二甲双胍预处理后冷冻解冻卵母细胞；
[0029]图7为不同浓度鱼藤酮处理对猪卵母细胞线粒体温度的影响，A图为经不同浓度鱼
藤酮处理的卵母细胞MTY荧光染色；B图为不同组别卵母细胞MTY荧光强度比较；
[0030]图8为鱼藤酮处理对猪卵母细胞发育的影响，A图为不同组别卵母本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过降低线粒体温度提高卵母细胞冷冻效果的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)卵母细胞冷冻前采用培养液进行预处理，所述培养液含二甲双胍；(2)将预处理后的卵母细胞置于20％乙二醇溶液中进行平衡处理，然后置于玻璃化冷冻液中进行冷冻，并投入液氮冷冻保存。2.根据权利要求1所述的提高卵母细胞冷冻效果的方法，其特征在于，步骤(1)所述培养液为TL
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HEPES
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0.3％BSA液。3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅祥伟，李俊，周丹，周桂珍，侯云鹏，
申请(专利权)人：河北医科大学第一医院，
类型：发明
国别省市：